Фазовый контраст

Различия в поглощении света часто незначительны между живыми клетками и окружающей их питательной средой, а также между различными внутриклеточными компонентами и плазматическими мембранами, что делает эти объекты едва заметными при наблюдении за освещением ярким полем. Микроскопия контраста участка использует преимущество мельчайших разниц в показателя преломления внутри клетчатые компоненты и между unstained клетками и их окружающей водной средой для произведения контраста в этих и подобных прозрачных образцах.

Введение в фазово-контрастную микроскопию

Фазовая контрастная микроскопия, впервые описанная в 1934 году голландским физиком Фрицем Зернике, представляет собой оптический метод усиления контраста, который может быть использован для получения высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки (обычно в культуре), микроорганизмы, тонкие кусочки ткани, литографические узоры, волокна, латексные дисперсии, фрагменты стекла и субклеточные частицы (включая ядра и другие органеллы).

В действительности, метод контраста участка использует оптически механизм для того чтобы перевести мельчайшие изменения в участке в соответствуя изменения в амплитуде, которые можно визуализировать как разницы в контрасте изображения. Одним из главных преимуществ фазовой контрастной микроскопии является то, что живые клетки могут быть исследованы в их естественном состоянии без предварительного уничтожения, фиксации и окрашивания. В результате динамика протекающих биологических процессов может наблюдаться и регистрироваться в высоком контрасте с резкой четкостью мельчайших деталей образца.

На рис 1 представлена разрезная схема современного вертикального фазово-контрастного микроскопа, включающая схематическое изображение фазово-контрастной оптической последовательности. Частично когерентное освещение, производимое вольфрам-галогенной лампой, направляется через линзу коллектора и фокусируется на специализированном кольце (обозначенном конденсаторным кольцом) расположенный в передней фокальной плоскости конденсатора подкачки. Волновые фронты, проходящие через межтрубное пространство, освещают образец и либо проходят через ненарушенные, либо дифрагируют и замедляются в фазе структурами и фазовыми градиентами, присутствующими в образце. Рассеянный и дифрагированный свет, собираемый объективом, разделяется в задней фокальной плоскости фазовой пластинкой и фокусируется на промежуточной плоскости изображения для формирования конечного фазового контрастного изображения, наблюдаемого в окулярах.

До изобретения методов фазового контраста пропускаемое яркое освещение было одним из наиболее часто используемых режимов наблюдения в оптической микроскопии, особенно для неподвижных, окрашенных образцов или других типов образцов, имеющих высокое естественное поглощение видимого света. В совокупности образцы, легко изображаемые с подсветкой brightfield, называются объектами амплитуды (или образцами), поскольку амплитуда или интенсивность освещающих волновых фронтов уменьшается при прохождении света через образец.

Добавление оптических аксессуаров фазового контраста к стандартному микроскопу brightfield может быть использовано в качестве метода для придания контрастного эффекта в прозрачных образцах, напоминающего оптическое окрашивание (см. рис 2). Световые волны, которые дифрагируют и сдвигаются по фазе образцом (называемым фазовым объектом) может быть преобразовано контрастом участка в разницы в амплитуды которые наблюдаемы в окулярах. Большие, удлиненные образцы также легко визуализируются с помощью фазовой контрастной оптики из-за дифракционных и рассеивающих явлений, которые происходят на краях этих объектов. Производительность современных фазовых контрастных микроскопов настолько совершенна, что позволяет обнаруживать образцы, содержащие очень малые внутренние структуры или даже всего лишь несколько молекул белка, когда технология связана с электронным улучшением и последующей обработкой изображений.

На рис 2 представлено сравнение живых клеток в культуре, полученных как при ярком поле, так и при фазовом контрастном освещении. Клетки представляют собой глиальную ткань головного мозга человека, выращенную в монослойной культуре, купающейся в питательной среде, содержащей аминокислоты, витамины, минеральные соли и фетальную телячью сыворотку. В освещении brightfield ( рис 2(a)), клетки кажутся полупрозрачными только с сильно преломляющими областями, такими как мембрана, ядро и незакрепленные клетки (округлые или сферические), будучи видимыми. При наблюдении с использованием оптических аксессуаров фазового контраста в том же поле зрения обнаруживается значительно больше структурных деталей ( рис, б). Клеточные прикрепления становятся различимыми, как и большая часть внутренней структуры. Кроме того, резко улучшен контрастный диапазон.

Разработка цернике фазовой контрастной оптической теории является прекрасным примером того, как результаты исследований из узкоспециализированной области (в данном случае теоретической физики) могут дать инновационные новые разработки в, казалось бы, не связанных между собой дисциплинах, таких как биология и медицина. Во время Второй Мировой Войны компания Zeiss Optical Works в Йене, Германия, стала первым производителем, внедрившим практичную фазовую контрастную оптику в свои микроскопы. Непосредственное влияние на биологические исследования было значительным, и широкое применение метода продолжается и по сей день. Современные фазовые контрастные задачи, разработанные и произведенные Nikon и другими оптическими производителями, способны работать в сочетании со вспомогательными методами усиления контраста, такими как дифференциальный интерференционный контраст, флуоресценция и поляризованный свет. Эти задачи имеющиеся с внутренними плитами участка которые имеют меняя уровни абсорбциы и смещения участка surround (недиффрактированного) освещения для того чтобы произвести широкий спектр выборов интенсивности контраста и предпосылки образца для микроскопии контраста участка.

Взаимодействие световых волн с фазовыми образцами

Падающий волновой фронт, присутствующий в освещающем луче света, при прохождении через образец фазы разделяется на две составляющие. Основной компонент представляет собой недевиированный ( или недиффрактированный; нулевого порядка ) планарный волновой фронт, обычно называемый объемной (S ) волной, которая проходит через образец и вокруг него, но не взаимодействует с ним. Кроме того, отклоненный или дифрагированный сферический волновой фронт ( D- волна) также образуется, которая рассеивается по широкой дуге (во многих направлениях), проходящей через полную апертуру объектива. После выхода из плоскости образца объемные и дифрагированные световые волны входят в объективную переднюю линзу и затем фокусируются на промежуточной плоскости изображения, где они объединяются через интерференцию для получения результирующей волны частиц (часто называемой P-волной). Математическую зависимость между различными световыми волнами, генерируемыми в фазово-контрастной микроскопии, можно описать просто как:

P = S + D

Детектирование изображения образца зависит от относительных перепадов интенсивности, а следовательно, и от амплитуд волн частицы и окружающего пространства (P и S). Если амплитуды частиц и объемных волн существенно различаются в плоскости промежуточного изображения, то образец приобретает значительное количество контрастности и легко визуализируется в окулярах микроскопа. В противном случае образец остается прозрачным и выглядит так, как это было бы в обычных условиях яркого поля (при отсутствии фазового контраста или других методов усиления контраста).

С точки зрения изменения оптического пути между образцом и окружающей его средой, часть падающего светового фронта, проходящего через образец ( D-волна), но не проходящего через окружающую среду ( s-волна), немного замедляется. Для аргументов в фазовой контрастной микроскопии первостепенное значение имеет роль образца в изменении длины оптического пути (по сути, относительного сдвига фаз) проходящих через него волн. В классической оптике длина оптического пути (OPL ) через объект или пространство является произведением показателя преломления (n ) и толщины (t) объекта или промежуточной среды, как описано отношением:

Оптическая длина пути (OPL) = n × t

Когда свет переходит из одной среды в другую, скорость изменяется пропорционально разности показателей преломления между двумя средами. Таким образом, когда когерентная световая волна, излучаемая сфокусированной нитью микроскопа, проходит через образец фазы, имеющий определенную толщину (t ) и показатель преломления (n), волна либо увеличивается, либо уменьшается в скорости. Если показатель преломления образца больше, чем у окружающей среды, то волна уменьшается в скорости при прохождении через образец и затем замедляется в относительной фазе, когда она выходит из образца. В отличие от этого, когда показатель преломления окружающей среды превышает показатель преломления образца, волна продвигается в фазе при выходе из образца. Разница в расположении возникающего волнового фронта между образцом и окружающей средой называется сдвигом фаз (δ) и определяется в радианах как:

δ = 2πΔ/λ

В уравнении выше термин D называется оптической разностью путей , которая аналогична оптической длине пути:

Оптическая разность хода (ОПД) = Δ = (n 2 - n 1 ) × t

где n(2) - показатель преломления образца, а n (1) - показатель преломления окружающей среды. Оптическая разность хода получается из произведения двух слагаемых: толщины образца и его разности по показателю преломления с окружающей средой. Во многих случаях оптическая разность хода может быть довольно большой, даже если толщина образца невелика. С другой стороны, когда показатель преломления образца равен показателю преломления окружающей среды, оптическая разность хода равна нулю независимо от того, является ли толщина образца большой или малой.

ля индивидуальных клеток в культуре ткани, оптически разница в пути относительно мала. Типичная клетка в монослойной культуре имеет толщину около 5 микрометров и показатель преломления приблизительно 1,36. Клетка окружена питательной средой с показателем преломления 1,335, что дает оптическую разность хода 0,125 мкм, или около четверти длины волны (зеленого света). Субклеточные структуры генерируют гораздо меньшие задержки. Эти небольшие оптические различия траекторий приводят к линейному снижению интенсивности с увеличением фазового сдвига (изображение становится все темнее) вплоть до точки (в зависимости от конфигурации фазовой пластины), после чего изображение образца становится ярче за счет изменения контраста. В фазовой контрастной микроскопии интенсивность изображения не имеет простой линейной зависимости от оптической разности хода, создаваемой образцом для всей толщины и диапазона показателя преломления. Напротив, интенсивность зависит от различных факторов, включая поглощение на фазовой пластине, степень продвижения или замедления фазы на фазовой пластине и относительный знак этого сдвига фазы.

Волновые взаимодействия в фазово-контрастной микроскопии

Фазовые соотношения между объемной, дифрагированной и частичной ( S , D и P ) волнами в области образца на плоскости изображения для яркопольной микроскопии (при отсутствии фазового контраста оптических аксессуаров). Объемные волны и волны частиц, относительные амплитуды которых определяют величину контраста образца, показаны в виде красных и зеленых линий (соответственно). Волна, полученная дифракцией от образца, которая никогда непосредственно не наблюдается, изображается как синяя волна меньшей амплитуды. Объемные и дифрагированные волны рекомбинируют через интерференцию для получения результирующей волны частиц в плоскости изображения микроскопа. Амплитуда каждой волны, представляет собой сумму электрических векторов отдельных составляющих волн.

По отношению к объемной волне дифрагированная волна имеет меньшую амплитуду (поскольку в точке изображения дифрагированных фотонов меньше, чем объемных) и задерживается по фазе примерно на 90 градусов (четверть длины волны) при взаимодействии с образцом. Небольшой фазовый сдвиг 1/20 длины волны, проявляемый результирующей волной частиц (которая возникает из-за интерференции между дифрагированными и объемными волнами), обычно наблюдается для мельчайших деталей в ячейке и связан с разностью оптических длин пути. Поскольку амплитуды объемных и частичных волн почти одинаковы, прозрачный образец полностью лишен контрастности и почти невидим при наложении на яркий фон.

Связь между отдельными волновыми фронтами в ярком поле и фазовой контрастной микроскопии может быть описана векторно с использованием системы полярных координат. В этой системе длина вектора представляет амплитуду определенной волны, в то время как угол поворота вектора относительно неподвижного эталона (угловой сдвиг фазы) означает степень смещения фазы . Векторное представление волновых взаимодействий в фазово-контрастной микроскопии было введено Фрицем Цернике, а позднее детально разработано Робертом Барером. Хотя эта описательная помощь редко используется сегодня, многие тексты и исследовательские отчеты, опубликованные за последние несколько лет, основываются на обсуждениях волновых отношений, иллюстрируемых векторными диаграммами.

На векторных диаграммах фазового контраста фазовые задержки иллюстрируются как вращения по часовой стрелке (со ссылкой на произвольный Азимут), в то время как фазовые сдвиги изображаются как вращения против часовой стрелки.Технически является диаграммой фазора, векторная сумма объемных ( S ) и дифрагированных (D ) волновых фронтов дает результирующую частицу (P) волновой фронт. Этот механизм представления волновых соотношений удобен тем, что он помогает визуализировать фазовые сдвиги в дифрагированной волне и то, как они влияют на фазу результирующей волны частиц (и наоборот). Фазовый сдвиг дифрагированной волны относительно объемной волны на графике представлен в виде Φ, где:

Φ = ± 90° + φ/2

В уравнении φ-относительный фазовый сдвиг (функция оптической разности хода) между окружающими ( S ) и частицами (P ) волновыми векторами. Для образцов, демонстрирующих незначительную оптическую разность хода (по сути, отсутствие сдвига фаз), последний член уравнения равен нулю и Φ становится ± 90 градусов. дифракционная (D) волна, имеющая очень низкую амплитуду и небольшой (или несуществующий) фазовый сдвиг, приводит к частичной волне с амплитудой, которая почти равна амплитуде объемной волны. Когда объемные волны и волны частиц имеют одинаковые амплитуды (или интенсивности), отсутствует генерация контраста, и образец остается невидимым на ярком фоне.

Фазовый Контрастный Микроскоп

Наиболее важной концепцией, лежащей в основе конструкции фазового контрастного микроскопа, является сегрегация объемных и дифракционных волновых фронтов, возникающих из образца, которые проецируются на различные положения в объективной задней фокальной плоскости (дифракция плоскость у заднего проема объектива). Кроме того, амплитуда объемного (недевиированного) света должна быть уменьшена, а фаза увеличена или замедлена (на четверть длины волны), чтобы максимизировать различия в интенсивности между образцом и фоном в плоскости изображения. Механизм для генерации относительного замедления фазы представляет собой двухэтапный процесс, при котором дифрагированные волны задерживаются в фазе на четверть длины волны в образце, в то время как объемные волны продвигаются (или замедляются) в фазе фазовой пластиной, расположенной в или очень близко к объективной задней фокальной плоскости. Только 2 специализированных вспомогательного оборудования необходимы для того чтобы преобразовать микроскоп для фазовой микроскопии для замечания контраста участка. В передней фокальной плоскости конденсатора размещена специально сконструированная кольцевая диафрагма, согласованная по диаметру и оптически сопряженная с внутренней фазовой пластиной, находящейся в задней фокальной плоскости объектива.

Кольцо конденсатора (проиллюстрированное на диаграмме 1 и диаграмме 3) типично построено как непрозрачная плоск-черная (светопоглощающая) плита с прозрачным кольцевым кольцом, которое расположено в переднюю фокальную плоскость (апертуру) конденсатора поэтому образец может быть освещен расфокусированными, параллельными светлыми волновыми фронтами исходящими от кольца. Конденсор микроскопа изображает кольцевую диафрагму на Бесконечности, в то время как объектив производит изображение в задней фокальной плоскости (где расположена сопряженная фазовая пластина, как описано ниже). Следует отметить, что во многих текстах освещение, возникающее из конденсатора фазового контрастного микроскопа, описывается как полый конус света с темным центром. Это понятие полезно для описания конфигурации, но не является строго точным. Кольцевое пространство конденсатора либо заменяется, либо располагается вблизи регулируемой диафрагмы радужки в переднем отверстии конденсатора. При проведении экспериментов по контрастированию фаз с использованием конденсатора, имеющего как фазовое кольцо, так и апертурную диафрагму, убедитесь, что диафрагма диафрагмы открыта шире, чем периферия фазового кольца. В отличие от дифференциального интерференционного контраста и модуляционного контраста Хоффмана, круговая геометрия фазового контрастного освещения и детектирования позволяет осуществлять наблюдение образцов без артефактов, зависящих от ориентации. Фазовый контраст также нечувствителен к эффектам поляризации и двулучепреломления, что является важным преимуществом при исследовании живых клеток, растущих в сосудах из пластмассовой культуры тканей.

В условиях освещения Келера объемные световые волны, не взаимодействующие с образцом, фокусируются в виде яркого кольца в задней фокальной плоскости объектива (дифракционной плоскости). В этих условиях задняя фокальная плоскость объектива сопряжена с передней апертурной плоскостью конденсатора, поэтому недифрактированные (нулевого порядка) световые волны формируют яркое изображение кольцевого пространства конденсатора на задней апертуре объектива (накладываются на изображение фазовой пластины). Сферический волновой фронт, который дифрагирует на образце (D волны) проходит через дифракционную плоскость в различных местах по всей задней апертуре объектива. Распределение (количество и расположение) дифрагированного света зависит от количества, размера и разности показателей преломления светорассеивающих объектов в образце. Для большинства образцов только небольшая часть падающих световых волн дифрагирует, и большая часть света проходит через неизмененный свет, чтобы в конечном итоге осветить всю плоскость изображения.

В отличие от этого объемный планарный волновой фронт занимает меньшую долю задней апертуры объектива,что соответствует сопряженному кольцу конденсатора. Таким образом, два волновых фронта не перекрываются в значительной степени и занимают отдельные участки задней фокальной плоскости объектива. Поскольку прямой свет нулевого порядка и дифрагированный свет пространственно разделены в дифракционной плоскости, фаза любой из волновых компонент (объемный, S или дифрагированный, D ) может быть избирательно манипулирована без вмешательства в другую.

Фазовая пластина устанавливается в задней фокальной плоскости объектива или рядом с ней (см. Рис.3 и 4) для избирательного изменения фазы и амплитуды объемного (или неизмененного) света, проходящего через образец. В некоторых задачах контраста участка, тонкая плита участка содержит кольцо вытравленное в стекло которое уменьшало толщину дифференциально для того чтобы выдвинуть участок surround ( s) волна на четверть длины волны. Часто кольцо также покрывается частично поглощающей металлической пленкой, чтобы уменьшить амплитуду объемного света на 60-90 процентов. Поскольку задняя фокальная плоскость обычно располагается вблизи внутреннего элемента объектива, некоторые фазовые контрастные объекты получаются путем фактического травления на поверхности объектива. Независимо от того, как производится объектив, наиболее важным моментом, который следует помнить, является то, что каждый фазовый контрастный объектив модифицируется, чтобы включить фазовую пластину, особенность, которая отсутствует во всех других задачах микроскопа.

Поскольку результирующая волна частиц создается исключительно интерференцией объемного и дифрагированного волновых фронтов, интерференция между волновыми фронтами, поступающими на плоскость изображения, генерирует частицу ( P) волны, имеющие амплитуду, которая в настоящее время значительно меньше, чем у объемного при нанесении покрытия нейтральной плотности. Чистый эффект заключается в преобразовании относительной разности фаз, вносимых образцом, в разность амплитуд (интенсивности) света, выходящего из плоскости изображения. Поскольку человеческий глаз интерпретирует различия в интенсивности как контраст, образец теперь виден в окулярах микроскопа, а также может быть снят на пленку с помощью традиционной системы камеры или в цифровом виде с использованием устройства CCD или CMOS. Все позитивно системы фазового контраста избирательно продвигают фазу линейного объемного ( S ) волнового фронта относительно фазы сферического дифрагированного (D ) волнового фронта. В качестве альтернативы отрицательный фазовый контраст замедляет окружающий волновой фронт по отношению к световым волнам, дифрагированным образцом.

В целом, образцы, имеющие более высокий показатель преломления, чем окружающая среда, кажутся темными на нейтральном сером фоне, в то время как те образцы, которые имеют более низкий показатель преломления, чем среда для купания, выглядят ярче, чем серый фон. Однако это не всегда так, поскольку специализированные фазовые контрастные задачи, имеющие более высокие нейтральные плотности в сочетании с более низкими значениями замедления (один-восемь длин волн или меньше), могут вызвать инверсию контраста в более толстых образцах. В результате области с очень высокими оптическими различиями траекторий начинают казаться яркими.

Для изменения фазы и амплитуды пространственно разделенных объемных и дифрагированных волновых фронтов в фазовых контрастных оптических системах был введен ряд конфигураций фазовых пластин. Поскольку фазовая пластина расположена в задней фокальной плоскости объектива или очень близко к ней (дифракционная плоскость), весь свет, проходящий через микроскоп, должен проходить через этот компонент. Часть фазовой пластины, на которой сосредоточено кольцо конденсатора, называется сопряженной областью , в то время как остальные области в совокупности называются дополнительной областью. Сопряженная область содержит материал, ответственный за изменение фазы объемного (недиффрактированного) света либо на плюс, либо на минус 90 градусов относительно фазы дифрагированных волновых фронтов. В общем случае область сопряжения фазовых пластин шире (примерно на 25%), чем область, определенная изображением кольцевого пространства конденсатора, чтобы минимизировать количество объемного света, распространяющегося в дополнительную область.

Типичная серия фазовых контрастных задач, имеющих увеличивающееся увеличение, и соответствующие им конденсаторные кольца представлены на рис 5. Как правило, при увеличении объективной числовой апертуры и увеличения ширина и диаметр фазовой пластины уменьшаются. В отличие от этого, размер кольца конденсатора увеличивается с объективным увеличением. Также проиллюстрировано на рисунке 4 приведены разрезные диаграммы, показывающие Основные понятия, лежащие в основе конструкции положительных и отрицательных фазовых пластин. Пластина с положительной фазой создает темный контраст и содержит частично поглощающую пленку, предназначенную для уменьшения амплитуды объемного волнового фронта. Кроме того, эта пластина содержит фазовый замедляющий материал, предназначенный для смещения (задержки) фазы дифрагированного света на 90 градусов. Отрицательная плита участка также содержит и материалы участка задерживая в развитии и частично поглощая. Однако в этом случае оба материала находятся внутри фазовой пластины так, что недифференцированный объемный волновой фронт является единственным видом воздействия (ослабленным и замедленным по фазе на 90 градусов).

Большинство фазовых пластин, доступных у современных производителей микроскопов, получают путем вакуумного осаждения тонких диэлектрических и металлических пленок на стеклянную пластину или непосредственно на одну из поверхностей линзы в объективе микроскопа. Роль диэлектрической тонкой пленки заключается в смещении фазы света, в то время как металлическая пленка ослабляет недиффрактированную интенсивность света. Некоторые производители используют несколько просветляющих покрытий в сочетании с тонкими пленками для уменьшения количества бликов и рассеянного света, отраженного обратно в оптическую систему. Если фазовая пластина не сформирована на поверхности линзы, она обычно склеивается между последовательными линзами, которые находятся вблизи задней фокальной плоскости объектива. Толщина и показатели преломления диэлектрических, металлических и антибликовых пленок, а также оптических цементов тщательно подбираются для получения необходимого фазового сдвига между комплементарными и сопряженными областями фазовой пластины. В оптической терминологии фазовые пластины, которые изменяют фазу объемного света относительно дифрагированного света на 90 градусов (положительную или отрицательную), называются четвертью длины волны пластины из-за их влияния на оптическую разность хода.

Контрастность модулируется путем изменения свойств фазовой пластины, включая поглощение металлической пленки (или антибликовых покрытий), показатель преломления фазового замедляющего материала и толщину фазовой пластины. Несколько изготовлений микроскопа предлагают разнообразие задачи контраста участка имея прогрессивные степени контраста. Например, линейка Nikon включает в себя пять типов задач фазового контраста. The DL (Dark Low) серия задач создает темный контур изображения на светло-сером фоне. Эти задачи конструированы для обеспечения положительного контраста в образцах имея значительную разницу в показателе преломления от окружающей среды, как клетки культуры ткани. Немного более низкая контрастность версии objective, DLL (Dark Low Low), дает лучшие изображения в косом освещении, чем у целей DL, и используется в качестве универсального объекта для комбинированных наблюдений в флуоресценции, косого освещения, темное полеи дифференциального интерференционного контраста.

Nikon также производит аподизированные фазовые контрастные задачи, которые содержат вторичное кольцо нейтральной плотности, предназначенное для уменьшения артефактов гало, по обе стороны от центрального фазового кольца. Образцы, имеющие очень малые разности фаз, являются идеальными кандидатами для получения изображений с помощью DM ( Dark Medium ) положительных фазовых контрастов, которые создают темный контур изображения на среднем сером фоне. Для отрицательного контраста участка, Nikon предлагает BM ( яркое средство) объективный, который особенно подходит для визуального исследования бактериальных жгутиков, простейших, фибриновых волокон, мельчайших глобул и клеток крови. Яркие средние цели контраста участка производят яркие изображения на средней серой предпосылке. Nikon дополнительно предлагает внешний модуль участка для некоторых перевернутых моделей микроскопа который позволяет потребителям сделать воображение контраста участка с задачами контраста высокой эффективности non-phase. Этот модуль позволяет вводить затрубное пространство фазы на плоскости, сопряженной с задней апертурой объектива.

В большинстве случаев простое продвижение относительной фазы объемного волнового фронта само по себе недостаточно для получения высококонтрастных изображений в микроскопе. Это происходит потому, что амплитуда объемных волн значительно больше, чем амплитуда дифрагированных волн, и подавляет результирующие изображения, созданные интерференцией только от небольшой части общего числа волн. Для уменьшения амплитуды объемного волнового фронта до величины, близкой к величине дифракционной волны (и усиления интерференции на плоскости изображения), фазовая пластина в объективе увеличивается в непрозрачности за счет нанесения полупрозрачного металлического (нейтральной плотности) покрытия. Объемные световые волны, которые проходят почти исключительно через фазовую пластину по конструкции в фазовом контрастном микроскопе, резко уменьшаются по амплитуде непрозрачной фазовой пластиной до значения, которое составляет от 10 до 30 процентов от первоначальной интенсивности.

Конфигурации фазовых пластин, волновые соотношения и векторные диаграммы, связанные с формированием положительных и отрицательных фазовых контрастных изображений, представлены на рис 5. Кроме того, приводятся примеры образцов, полученных с помощью этих методов. Как уже говорилось ранее, сферический волновой фронт дифрагированного света, выходящего из плоскости образца, замедляется на четверть длины волны относительно фазы планарного объемного (или недиффракционного) волнового фронта. В оптической конфигурации с положительным фазовым контрастом (верхняя строка изображений на рис 5) объемное изображение (S) wavefront выдвинут в участок четверт-длиной волны пересекая плиту участка для того чтобы произвести сетчатый сдвиг фазы 180 градусов (одной половинной длины волны). Расширенный объемный волновой фронт теперь способен участвовать в разрушительной интерференции с дифрагированными (D ) волнами на промежуточной плоскости изображения.

Обзор положительного фазового контраста представлен в верхней части рис 5. Положительные фазовые контрастные пластины (левая сторона рис 5) продвигают объемную волну на четверть длины волны за счет вытравленного кольца в стеклянной пластине, что уменьшает физический путь, проходимый волнами через пластину с высоким показателем преломления. Потому что дифрагированные лучи образца ( Dволны) замедляются на четверть длины волны при взаимодействии с образцом, оптическая разность хода между объемной и дифрагированной волнами при выходе из фазовой пластины составляет половину длины волны. Конечным результатом является 180-градусная оптическая разность хода между объемной и дифрагированной волнами, что приводит к разрушительной интерференции для образца с высоким показателем преломления на плоскости изображения. Амплитудные профили деструктивно интерферирующих волн для положительного фазового контраста изображены на верхнем графике рис 5. Амплитуда результирующей частицы ( P) волна ниже, чем окружающая ( ые ) волна, в результате чего объект выглядит относительно темнее фона, как показано на изображении зеленых водорослей Zygnema в дальнем правом углу (помечено POS ). Векторная диаграмма, иллюстрирующая продвижение объемной волны на четверть длины волны, которая показана в виде 90-градусного вращения против часовой стрелки в положительном фазовом контрасте, появляется между диаграммой и изображением на рис 5.

Кроме того, можно создавать микроскопические оптические системы, дающие отрицательный фазовый контраст, как показано в нижней части рис 5. В этом случае объемная (S ) волна замедляется ( а не продвигается) на четверть длины волны относительно дифрагированной (D ) волны. В результате образцы с высокими показателями преломления кажутся яркими на более темном сером фоне (см. изображение с надписью NEG в нижней части рис 5). В отрицательном фазовом контрасте объективная фазовая пластина содержит повышенное кольцо, которое замедляет фазу (а не продвигает фазу, как в положительном фазовом контрасте) окружной волны нулевого порядка на четверть длины волны относительно фазы дифрагированной волны. Поскольку дифрагированная волна уже была задержана на четверть длины волны при прохождении через образец, оптическая разность хода между объемной и дифрагированной волнами устраняется, и для образца с высоким показателем преломления на плоскости изображения возникает конструктивная интерференция. Заметим, что полученная частица (P) волна имеет большую амплитуду, чем Окружная ( S ) волна с отрицательным фазовым контрастом (см. нижний график на рис 5). Также проиллюстрирована векторная диаграмма для отрицательного фазового контраста, где окружающий волновой вектор подвергается вращению на 90 градусов по часовой стрелке.

Важно отметить, что дифракционная картина, формируемая на задней фокальной плоскости объектива, является Фурье-преобразованием всех пространственных частот, отклоненных и рассеянных образцом в фазовом контрасте, а также во всех других формах оптической микроскопии. Следовательно, изображение, полученное на промежуточной плоскости изображения, и конечное изображение, наблюдаемое через окуляры (или регистрируемое детектором), представляют собой обратные преобразования Фурье дифракционных картин, сформированных на задней фокальной плоскости объектива и окулярной точке (плавающей над передней линзой окуляра) соответственно. Микроскопия контраста участка использует преимущество этих оптически сопряженных свойств для того чтобы увеличить контраст изображения путем дорабатывать функцию апертуры микроскопа для того чтобы ввести пространственную фильтрацию специфической информации по изображения. Введение фазовой пластины (фильтра) в объективную заднюю дифракционную плоскость позволяет трансформировать фазовые колебания образца в вариации интенсивности, которые можно наблюдать на конечном изображении.

Интерпретация фазовых контрастных изображений

Изображения, полученные с помощью фазовой контрастной микроскопии, относительно легко интерпретируются, когда образец тонкий и равномерно распределен на подложке (как в случае с живыми клетками, выращенными в монослойной культуре тканей). При исследовании тонких образцов с использованием положительной фазовой контрастной оптики, которая является традиционной формой, выпускаемой большинством производителей, они кажутся темнее окружающей среды, когда показатель преломления образца превышает показатель преломления среды. Фазовая контрастная оптика дифференциально усиливает контраст вблизи краев, окружающих протяженные образцы, таких как граница между клеточной мембраной и питательной средой для купания, и создает общие высококонтрастные изображения, которые могут быть грубо интерпретированы как карты плотности. Поскольку амплитуда и интенсивность изображения образца в фазовом контрасте связаны с показателем преломления и длиной оптического пути, плотность изображения может быть использована в качестве датчика для аппроксимации отношений между различными структурами. В действительности, ряд внутренних клеточных органелл, имеющих увеличивающуюся плотность, таких как вакуоли, цитоплазма, межфазное ядро и ядрышко (или митотические хромосомы), обычно визуализируются как постепенно более темные объекты относительно фиксированной ссылки, такой как фон. Следует также отметить, что на всех фазовых контрастных изображениях присутствуют многочисленные оптические артефакты, а на больших протяженных образцах часто наблюдаются значительные колебания контрастности и интенсивности изображения. Симметрия может также быть важным фактором в определении того, как большие и малые образцы появляются в микроскопе контраста участка.

Разумная интерпретация фазовых контрастных изображений требует тщательной проверки и изучения, чтобы убедиться, что артефакты не назначаются неверно важным структурным особенностям. Например, некоторые внутренние клеточные органеллы и компоненты часто имеют более низкий показатель преломления, чем у окружающей цитоплазмы, в то время как другие имеют более высокий показатель преломления. Из-за различных показателей преломления, проявляемых этими многочисленными внутриклеточными структурами, внутренняя часть живых клеток, рассматриваемая в положительном фазовом контрастном микроскопе, может выявить множество интенсивностей, варьирующихся от очень яркой до чрезвычайно темной. Например, пиноцитотические везикулы, липидные капли и воздушные вакуоли, присутствующие в растениях и одноклеточных простейших, имеют более низкий показатель преломления, чем цитоплазма, и, таким образом, выглядят ярче, чем другие компоненты. Напротив, как уже говорилось выше, органеллы, обладающие высокими показателями преломления (ядра, рибосомы, митохондрии и ядрышки), в микроскопе выглядят темными. Если фазовое замедление, вносимое образцом, достаточно велико (фазовый сдвиг дифрагированной волны примерно на половину длины волны), интерференция между дифрагированными волнами и окружающими волнами становится конструктивной, делая эти образцы ярче, чем окружающий фон.

Во избежание путаницы относительно яркого и темного контраста в изображениях контраста участка, оптически разницы в путя происходя внутри подготовка образца должны быть тщательно рассмотрены. Как обсуждалось выше, оптическая разность хода определяется произведением показателя преломления и толщины образца (объекта) и связана с относительным сдвигом фаз между образцом и фоновыми (дифрагированными и объемными) волнами. В фазово-контрастном изображении невозможно различить высокую и низкую составляющие показателя преломления без информации об относительной толщине компонентов. Например, небольшой образец с высоким показателем преломления может отображать одинаковую оптическую разность хода для большего образца с более низким показателем преломления. Эти два образца будут иметь приблизительно одинаковую интенсивность при просмотре через оптическую систему фазового контраста. Во многих биологических экспериментах условия, которые приводят к усыханию или набуханию клеток или органелл, могут приводить к значительным контрастным изменениям. Внешнюю среду можно также заменить на другую, имеющую либо более высокий, либо более низкий показатель преломления для получения изменений контрастности изображения образца. На самом деле, влияние на контраст изображения изменений показателя преломления в окружающей среде формирует основу метода, известного как иммерсионная рефрактометрия .

На рис 6 представлены несколько полупрозрачных образцов, полученных с помощью оптических систем с положительным и отрицательным фазовым контрастом. На рис. 6(А) и 6(б) показана чешуя ктеноидных рыб с положительным фазовым контрастом ( рис 6 (А)) и отрицательным фазовым контрастом ( рис. 6(В)) при относительно высоком увеличении (200х). Эти чешуйки обычно встречаются у большинства костистых рыб (называемых Телеостеи). Передняя (или передняя) часть каждой шкалы обычно заправляется за заднюю часть предыдущей шкалы. Как рыба растет, так и чешуя, в результате чего картина концентрического роста "кольца", которые увеличиваются в количестве с размером шкалы и появляются аналогичные тем, которые находятся в поперечном сечении стволов деревьев. В некоторых случаях для оценки возраста рыбы используются модели роста чешуи ctenoid. Ростовые кольца кажутся темными, окруженными более светлыми серыми областями ореола в положительном фазовом контрасте ( рис 6(a)), но оказываются значительно светлее и окружены темными впадинами с отрицательным фазовым контрастом (рис.6, б).

Культура живых клеток яичников китайского хомяка выглядит прозрачной в режиме косого освещения при купании в ростовой среде, и клетки имеют показатель преломления, который очень близок к питательному физиологическому буферу. В положительном контрасте участка (рис 6 (c) ), внутренние клетчатые детали, включая ядро и органеллы, можно охотно визуализировать. Однако при исследовании в условиях отрицательного фазового контрастного освещения очертания клеток становятся трудно различимыми, а внутренние детали в значительной степени затемняются за исключением органелл с высоким показателем преломления, которые становятся очень яркими (рис 6(d)). Наконец, эритроциты человека выглядят как темно-серые сплюснутые эллипсоиды, имеющие контур бублика и яркие центры в положительном фазовом контрасте (рис 6 ( e) ), но те же клетки яркие с темными центрами (рис 6(f) ) и резко выделяются на фоне в отрицательном фазовом контрасте.

Двумя весьма распространенными эффектами в фазовых контрастных изображениях являются характерные ореолообразные и затененные контрастные картины, в которых наблюдаемая интенсивность не соответствует непосредственно оптической разности хода (значения показателя преломления и толщины) между образцом и окружающей средой. Хотя эти картины происходят как естественный результат оптической системы контраста участка, они часто названы артефакты участка или искажения изображения. Во всех формах положительного контраста участка, яркие ореолы участка обычно окружают границы между крупными объектами образца и средой. Идентичные ореолы кажутся темнее, чем образец с отрицательной фазовой контрастностью оптических систем. Эти эффекты дополнительно усиливаются оптическими флуктуациями разности хода, которые могут сделать яркие ореолы темными в положительном фазовом контрасте и темные ореолы яркими в отрицательном фазовом контрасте.

Нимбы возникают при фазовой контрастной микроскопии, поскольку круговое фазово-замедляющее (и нейтральное по плотности) кольцо, расположенное в объективной фазовой пластине, также пропускает небольшую степень дифрагированного света от образца (это не ограничивается только прохождением объемных волн). Проблема усугубляется тем, что ширина объемного волнового фронта нулевого порядка, проецируемого на фазовую пластину кольцом конденсатора, меньше фактической ширины кольца фазовой пластины. Разница в ширине между фазовым пластинчатым кольцом и объемным волновым фронтом обычно составляет от 25 до 40 процентов, но это необходимо из-за ограничений и требований оптической конструкции. Из-за пространственного расположения кругового фазовращающего кольца в плоскости объективной дифракции только те волновые фронты, соответствующие низким пространственным частотам, дифрагированным образцом, проходят через кольцевое пространство фазовой пластины. Таким образом, дифрагированные волны образца, проходящие через фазовую пластину, остаются на 90 градусов (четверть длины волны) вне фазы по отношению к нулевому порядку (неизменному или объемному) свету. Полученный артефакт фазового контраста гало обусловлен затуханием низкочастотной пространственной информации, дифрагированной образцом под очень малым углом относительно объемных волновых фронтов нулевого порядка. В действительности, отсутствие деструктивной интерференции между дифракированными образцом волновыми фронтами низкой пространственной частоты и неперепряженными световыми волнами создает локализованный реверс контраста (проявляющийся ореолом), окружающим образец. Для того чтобы создать на изображении острый край, все пространственные частоты, дифракированные образцом, должны быть представлены на конечном изображении.

Фазовые контрастные ореолы особенно заметны и заметны вокруг крупных объектов с низкой пространственной частотой, таких как ядра, диатомовые тела и целые клетки. Другим фактором, влияющим на артефакт гало, является перераспределение световой энергии на плоскости изображения из областей, где она разрушительна, в области, где она конструктивна. Большие, сверхконтрастные ореолы могут произвести сбивающие с толку изображения для образцов производя большие оптически разницы в пути, как эритроциты, прессформы, простейшие, клетки дрождей, и бактерии. С другой стороны, эффекты ореола часто могут подчеркивать контрастные различия между образцом и его окружающим фоном и могут увеличивать видимость тонких краев и граничных деталей во многих образцах. Это влияние особенно полезно в отрицательном контрасте участка, который производит темный венчик окружая низкочастотную деталь изображения. Во многих случаях можно уменьшить степень сдвига фаз и дифракции, что приводит к уменьшению размера гало вокруг образца. Самым простым средством для удаления или ослабления интенсивности гало является изменение показателя преломления наблюдаемой среды с использованием более высоких компонентов показателя преломления, таких как глицерин, маннит, декстран или сывороточный альбумин. В некоторых случаях изменение показателя преломления среды может даже вызвать реверс контрастности изображения, превращая темные элементы образца в яркие без существенного нарушения интенсивности фона.

Эффект ореола можно также значительно уменьшить, используя специально разработанные фазовые задачи, которые содержат небольшое кольцо из материала нейтральной плотности, окружающего материал центрального кольца фазы вблизи задней апертуры объектива. Эти задачи называются аподизированным фазовым контрастом задачи, и позволяют структуры объектов участка имея большие разницы в участка быть осмотренным и сфотографированным с выдающей ясностью и определением детали. В большинстве случаев субклеточные признаки (такие как ядрышки) могут быть четко различимы как имеющие темный контраст с аподизированными объектами, но эти же признаки имеют яркие ореолы или изображаются в виде ярких пятен с использованием обычной фазовой контрастной оптики. С apodized оптикой, контраст обращенные должные к большой амплитуде дифрагированного света по отношению к тому из сразу света пропуская через образец.

На практике уменьшение ореола и увеличение контрастности образца с аподизированными оптическими системами может быть достигнуто за счет использования селективных амплитудных фильтров, расположенных рядом с фазовой пленкой в фазовых пластинах, встроенных в объектив в задней фокальной плоскости. Эти амплитудные фильтры состоят из тонких пленок нейтральной плотности, нанесенных на фазовую пластину, окружающую фазовую пленку. Коэффициент пропускания кольца фазового сдвига в классической фазовой пластине составляет приблизительно 25 процентов, в то время как пара соседних колец, окружающих кольцо фазового сдвига в аподизированной пластине, имеют нейтральную плотность с коэффициентом пропускания 50 процентов. Ширина фазовой пленки в обеих пластинах одинакова. Эти величины согласуются со значениями коэффициента пропускания фазовых сдвиговых тонких пленок, наносимых на стандартные пластины в фазово-контрастных микроскопах.

Затенение - другой очень общий оптически артефакт в микроскопии контраста участка, и часто наиболее легко наблюдаемо в больших, выдвинутых образцах участка. Обычно можно было бы ожидать, что изображение образца большой фазы, имеющего постоянную оптическую длину пути по диаметру, будет равномерно темным или светлым в микроскопе. К сожалению, интенсивность изображений, полученных с помощью фазового контрастного микроскопа, не всегда имеет простое линейное отношение к оптической разности хода, создаваемой образцом. Другие факторы, такие как поглощение на фазовой пластине и количество замедления или продвижения фазы, а также относительный размер перекрытия фазовой пластины и конденсаторного кольца также играют важную роль. Профиль интенсивности большого, равномерно Толстого образца с положительным фазовым контрастом часто постепенно увеличивается от краев к центру, где интенсивность света в центральной области может приближаться к интенсивности окружающей среды (обратное справедливо для образцов с отрицательной фазой). Этот эффект называется затенением и часто наблюдается при исследовании протяженных плоских образцов, таких как материальные плиты (стекло или слюда), реплики, уплощенные клетки культуры ткани и крупные органеллы.

Влияние артефактов гало-и затенения на положительный и отрицательный фазовый контраст представлено на рис 7 для гипотетического образца с удлиненной фазой, имеющего прямоугольную геометрию и более высокий показатель преломления, чем окружающая среда ( рис 7, а)). Профиль интенсивности, записанный в центральной области образца, показан на рис 7(b). В положительном контрасте участка ( рис 7(c)), изображение образца показывает отчетливо яркий ореол и демонстрирует драматический эффект затенения, который проявляется в постепенном увеличении интенсивности при переходе от краев к центральной области образца (см. профиль интенсивности на рис 7 (d)). Эффекты гало и затенения имеют обратную интенсивность в отрицательном фазовом контрасте (рис 7 е и 7f)). Изображение образца окружено темным ореолом при просмотре с помощью отрицательной фазовой контрастной оптики ( рис 7(e)), и переход тени - от яркого на краях к более темным серым уровням в центре. Кроме того, профиль интенсивности ( рис 7 (f) ) является обратным от наблюдаемого с положительным фазовым контрастом.

Явление затенения также обычно называют эффектом зоны действия, поскольку центральные зоны, имеющие равномерную толщину в дифракционном свете образца, отличаются от сильно преломляющих зон на краях и границах. В центральных областях образца как относительные углы, так и количество дифрагированного света резко уменьшаются по сравнению с краями. Поскольку дифрагированные волновые фронты, исходящие из центральных областей образца, имеют только предельное пространственное отклонение от ненулевых объемных волновых фронтов нулевого порядка (но все еще задерживаются по фазе на четверть длины волны), они захватываются фазовой пластиной в задней фокальной плоскости объектива вместе с объемным светом. В результате интенсивность центральной области образца остается по существу идентичной интенсивности фона. Появление затеняющих эффектов в относительно плоских плоскостных областях образца наряду с чрезмерно высоким контрастом, создаваемым краями и границами, дает убедительные доказательства того, что механизм фазового контраста в первую очередь управляется комбинированными явлениями дифракции и рассеяния.

Артефакты гало - и затенения зависят как от геометрических, так и от оптических свойств фазовой пластины и исследуемого образца. В частности, ширина и коэффициент пропускания материала фазовой пластины играют решающую роль в контроле этих эффектов (ширина фазовой пластины обычно составляет около одной десятой от общей площади апертуры объектива). Более широкие фазовые пластины с пониженным коэффициентом пропускания, как правило, создают более интенсивные ореолы и затенение, в то время как диаметр кольца оказывает меньшее влияние на эти эффекты. Для конкретной фазовой задачи (положительной или отрицательной) оптическая разность хода и размер образца, форма и структура оказывают значительное влияние на выраженность эффектов гало и затенения. Кроме того, эти эффекты в значительной степени зависят от объективного увеличения, причем более низкие увеличения дают лучшие изображения.

Конфигурация Микроскопа Контраста Участка

Компоненты контраста участка оптически можно добавить к виртуально любому микроскопу косое освещение, при условии специализированные задачи участка соответствуют параметрам длины трубки, и конденсатор примет кольцевое кольцо участка правильного размера. Основные изготовители все обеспечивают вспомогательное оборудование контраста участка для их микроскопов исследования и учить-уровня, и в чистосердечных и перевернутых конфигурациях (культуры ткани).

Типичные компоненты фазового контраста, доступные для вертикальных исследовательских микроскопов motic серии BA210-BA410, показаны на рис 8 , хотя аналогичные аксессуары также производятся другими производителями. Конденсор, представленный на рис 8, представляет собой универсальную систему, предназначенную для применения в широком диапазоне увеличений (от 2x до 100x) , а также в качестве вспомогательного оборудования для нескольких методов повышения контраста, включая дифференциальный интерференционный контраст ( DIC), темное поле и фазовый контраст. Задачи, содержащие внутренние фазовые пластины, предлагаются с различными оптическими корректирующими коэффициентами, начиная от простых ахроматов и заканчивая плановыми апохроматами. В добавлении, плиты участка имеющиеся с несколькими уровней амортизации wavefront surround произвести разные степени контраста и интенсивности предпосылки. производители объективов для микроскопа, такие как Motic, обычно производят как положительные, так и отрицательные фазовые линзы.

Для выравнивания кольцевого зазора конденсатора с фазовой пластиной в задней фокальной плоскости объектива используется фазовый телескоп (как показано на рис 8) что вставки в одну из трубок замечания окуляра микроскопа можно использовать. Полный комплект фазовых аксессуаров может стоить от нескольких сотен до нескольких тысяч долларов, в зависимости от коэффициента объективной коррекции, сложности и оптической коррекции конденсатора подкачки, а также от того, включен ли в комплект фазовый телескоп. В следующих разделах более подробно описаны эти компоненты и представлено руководство по настройке и выравниванию фазово-контрастных микроскопов.

Конструкция Кольца Конденсатора

Фазовые контрастные кольца (annulus-латинский термин для обозначения кольца, причем множественное число является кольцом), используемые в конденсаторе подложки на вертикальном микроскопе или в башенке конденсатора на осветительной колонке перевернутого микроскопа, должны быть специально подобраны к определенной цели, оснащенной соответствующей фазовой пластиной. Например, объектив 20x и объектив 100x, оба из которых содержат фазовую пластину вблизи дифракционной плоскости (задняя фокальная плоскость), потребуют наличия конденсорных колец с различными диаметрами, соответствующими объективному увеличению и числовой апертуре. Путем соответствовать кольцу конденсатора к объективной плите участка, микроскоп можно выровнять для того чтобы перекрыть освещающие световые лучи пропущенные через кольцо участка на объективное кольцо участка для того чтобы достигнуть освещения контраста участка.

Большинство популярных универсальных конденсаторных систем, предназначенных для фазовой контрастной микроскопии, оснащены тремя и более съемными кольцевыми диафрагмами, которые доступны для использования с задачами 4x, 10x, 20x, 40x, 60x и 100x, содержащими соответствующие фазовые пластины. Кольцо конденсатора Ph1 (или эквивалент), которое содержит самую малую апертуру, конструировано быть использованным с задачами более низкой силы 10x и 20x. Промежуточные задачи увеличения (40x и 60x) используют кольцо Ph2, пока задачи самой высокой силы (и численной апертуры) 100x требуют Ph3 затрубное пространство, которое содержит самое большое отверстие. Специализированное кольцо конденсатора (PhL ) использовано с задачами низк-увеличения (4x и 5x) когда качани-объектив конденсатора извлечется от оптически тропа или в длинних конденсаторах расстояния деятельности конструированных для перевернутых микроскопов культуры ткани.

Кольцевые вставки конденсатора представляют собой круговые алюминиевые пластины, имеющие в центре штампованное кольцо различных размеров (как показано на рисунках 8 и 9). После операции штамповки кольцевые дисковые блоки анодируются и окрашиваются плоским черным пигментом для поглощения рассеянного света и обеспечения того, чтобы световые лучи, проходящие через кольцо, следовали по определенному пути. Центральный световой упор, размер которого варьируется в зависимости от апертуры целевого объектива и диапазона увеличения, расположен в центре пластины и закреплен тремя тонкими лепестками, расположенными через 120-градусные интервалы. Кольцевая пластина либо прессована, либо склеена в круглую рамку (также анодированную и окрашенную в черный цвет), которая вставлена в круглое отверстие в башенке конденсатора.

Современная универсальная турель (см. рис 9) обычно содержат между 5 и 8 открытыми положениями шлица которые можно приспосабливать с кольцевыми плитами контраста участка, плитами призмы dic Nomarski (Wollaston), или плитами стопа темным полем и светлыми. Основная конструкция этих плит аналогична. Стопы темного поля светлые изготовлены в образе подобном к диафрагмам участка кольцевым, но кольцо вообще шире и имеет более большой диаметр для того чтобы позволить сильно косые светлые волновые фронты пройти до конца. Напротив, призмы DIC отрезаны в круговые слябы которые склеены в анодированную рамку и введены в башенку.

Кольцевые мембранные пластины конденсатора фазового контраста вставляются в соответствующее положение в башне и закрепляются на месте с помощью пружинного зажима, который перемещается внутри периферии отверстия башни. Натяжение пружинного зажима заставляет кольцевую пластину прижиматься к набору регулировочных винтов (или резьбовых штифтов), используемых для центрирования кольцевого канала в оптическом тракте (как показано на рис 10). Несколько изготовлений предлагают системы конденсатора конструированные специфически для контраста участка которые отличают объединенным кольцом центризуя систему. Эти конденсаторы обычно имеют набор регулировочных ручек, которые могут приводиться в действие путем нажатия на вал каждой ручки до тех пор, пока он не зафиксируется в кольцевом регулировочном винте. После того как винты включены, переплетать ручки позволит оператор центризовать кольцо конденсатора по отношению к объективной плите участка.

Всякий раз, когда универсальный конденсатор микроскопа используется для наблюдения фазового контраста, оператор должен обязательно изучить положение рычага апертурной диафрагмы, чтобы убедиться, что диафрагма открыта шире, чем диаметр кольца конденсатора. На самом деле, это хорошая идея, чтобы всегда открывать диафрагму в самое широкое положение во время фазовых контрастных наблюдений. Несколько изготовителей предлагают конденсаторы конструированные исключительно для контраста участка, которые имеют spring-loaded механизм который автоматически раскрывает диафрагму радужки апертуры конденсатора когда кольцо участка вращано в оптически тропу, но отключает эту характеристику для замечания косого освещение с таким же конденсатором. После завершать эксперименты по контраста участка, микроскоп можно возвратить в режим косого освещение и отверстие диафрагмы радужки конденсатора отрегулированное согласно объективной численной апертуре.

Конденсаторы контраста участка имеющиеся в широком спектре оптически уровней коррекции, колебаясь от основной конструкции Abbe (никакой коррекции для хроматичной или сферически аберрации) к высоки исправленным aplanatic-ахроматическим системам которые отличают превосходным представлением. В добавлении, специализированные конденсаторы контраста участка имеющиеся с оптикой длиннего расстояния деятельности (LWD), и для чистосердечных и перевернутых микроскопов, для того чтобы позволить воображению образцов, Котор содержат в толщиных сосудах. Много из микроскопов перевернутых исследовани-рангом имеют экстренное длиннее расстояние деятельности ( ELWD) конденсаторы с фазовыми кольцами, которые позволяют наблюдать за живыми клетками в очень больших контейнерах.

Спецификации для аксессуаров контраста участка могут поменять значительно от одного изготовителя к другим, и никакой принятый стандарт для размеров диафрагмы участка Кольцевой (и объективной плиты участка) по отношению к или численной апертуре или увеличению. В результате задачи фазового контраста от одного производителя микроскопов обычно не могут быть связаны с фазовым конденсатором от другого (и наоборот).

Однократные кольцевые фазовые конденсаторы одно время были очень популярны, но в значительной степени вытеснены универсальными башенными моделями. Более старые конденсаторы требуют удаления и ввода различных кольцевых фаз по мере изменения цели, что является громоздкой и трудоемкой задачей,которую часто приходится повторять при исследовании мелких деталей образцов при нескольких увеличениях. Центрирование кольцевой диафрагмы в одиночном кольцевом конденсаторе выполнено в образе подобном этому из более новых, всеобщих конденсаторов. Для прижатия кольцевой пластины к листу или пружинному блоку внутри корпуса конденсатора используются либо плоскостные, либо шестигранные резьбовые штифты, либо винты.

Чтобы приспособить стандартный аббревиатурный, ахроматический или апланатический конденсатор подложки для фазовых контрастных наблюдений, необходимо установить механизм для размещения кольцевой диафрагмы в передней фокальной (апертурной) плоскости конденсатора или очень близко к ней. Несколько моделей конденсатора изготовлены с диафрагмой радужки апертуры (всегда расположенной в фокальной плоскости) расположенной на основании конденсатора, за шлицами конструированными для того чтобы признавать плиты участка или стопы темного поля светлые. Другие конденсаторы имеют плоскость апертуры, расположенную в центральной области корпуса, которая относительно недоступна для вспомогательных компонентов, таких как фазовое кольцо.

Задачи Фазового Контраста

Наиболее важным признаком объектов, предназначенных для фазовой контрастной микроскопии, является наличие специализированной фазовой пластины, расположенной в дифракционной или задней фокальной плоскости или очень близко к ней. Фазовые пластины не взаимозаменяемы между объективами и часто постоянно вытравлены в один из внутренних линзовых элементов. Вытравленное кольцо покрыто с частично поглощающей металлической пленкой которая уменьшает светлую передачу, и обычно сделано так, что участок света пропуская до конца будет выдвинут одной четвертью длины волны по отношению к свету который передан через остальнои стекла.

Диаграмма среза типичного фазового контрастного объектива показана на рис 11. Вставка иллюстрирует фазовую пластину, расположенную в задней фокальной плоскости. Другие части объектива, включая большинство внутренних линзовых элементов, идентичны по конструкции стандартными объективами микроскопа. Диапазон задач фазового контраста, доступных от основных производителей, охватывает практически полный спектр корректирующих факторов, . Эти задачи также доступны с воротами коррекции coverslip (для сухих высоких задач численной апертуры) и для методов погружения в воде, глицерине, и масле. В добавлении, задачи контраста участка изготовлены которые меняют в нейтральной плотности и значении заторможенности плиты участка для того чтобы произвести широкий спектр уровней контраста как в положительных, так и в отрицательных режимах контраста участка.

Motic и другие производители выпускают различные цели фазового контраста , которые различаются по знаку (положительному или отрицательному) и варьируются от относительно низкого до очень высокого контраста. В положительном фазовом контрасте, наиболее распространенной форме, оптически плотные участки тонкого образца кажутся темными на фоне, имеющем более светлый оттенок серого. Отрицательный фазовый контраст делает образцы яркими, но накладывается на темный фон, похожий на освещение темного поля.

представлено сравнение цифровых изображений, записанных с использованием доступных в настоящее время задач фазового контраста, для демонстрации вариаций контраста, вызванных изменением уровня нейтральной плотности фазовой пластинки и замедления (или продвижения) окружающего волнового фронта. Изображения представляют собой одно и то же видовое поле от неподвижного и навесного препарата Зигнема из нитчатых водорослей. сравнение темных низких низких, темных низких и фазовыми контрастными объективами (DLL, DL и ADL, соответственно), которые производят аналогичные степени контрастности на относительно светло-сером фоне. На темном и ярком средних значениях фазового контраста наблюдается положительный и отрицательный фазовый контраст на среднем сером фоне.

Степень контрастности образца, обеспечиваемая различными типами фазовых контрастных объектов, осложняется тем фактом, что большие колебания показателя преломления и толщины могут приводить к инверсии контраста и значительному рассеянию света из областей образца вдали от фокальной плоскости. Плотность поглощающего материала, наносимого на фазовую пластину (для ослабления волнового фронта объемного света), и фазовые сдвигающие свойства (которые замедляют или продвигают волновой фронт объемного света) фазовых пластин оказывают значительное влияние на результаты, наблюдаемые в фазовом контрастном микроскопе. Ниже перечислены некоторые важные особенности различных фазовых контрастных задач, производимых компанией Nikon.

• DL (Dark Low - Medium Contrast) - задачи DL создают темный контур изображения на светло-сером фоне и являются типичными задачами, используемыми для многоцелевого наблюдения фазового контраста. Эти задачи конструированы для обеспечения самого сильного темного контраста в образцах имея главную разницу в показателе преломления от этой из окружающей среды. Цель контраста участка DL самый популярный тип для рассмотрения клеток и другого semi-transparent живущего материала и специально одета для фотомикрографии и цифрового воображения.
• DLL (темный низкий низкий - низкий контраст) - подобный в дизайне к задаче DL, серия DLL производит лучшие изображения в освещении brightfield и часто использована как "всеобщий" объектив в системах микроскопа которые используют множественные режимы освещения как флуоресцирование, DIC, косое освещение, и темное поле. Цель контраста участка DLL производит меньше контраста чем задача DL, но отличает более высокими значениями светлой передачи, оптически коррекцией, и численной апертурой чем стандартные двойники DL. Большинство целей контраста участка DLL предложенных изготовлениями имеют уровни коррекции флюорита или апохроматической аберрации.
• ADL (Apodized Dark Low - Medium Contrast) - недавно введенные Nikon, цели ADL apodized phase contrast содержат вторичное кольцо нейтральной плотности по обе стороны от центрального кольца в фазовой пластине. Добавление вторичных колец помогает в уменьшении излишних влияний "венчика" часто связанных с изображать большие частицы или особенности образца (как ядра, все клетки и волокна) в микроскопии контраста участка. apodized объектив имеющиеся в уровнях контраста коррекции и характеристики ахромата оптически подобных к серии задачи DL.
• DM (Dark Medium - High Contrast) - задачи DM создают темный контур изображения на среднем сером фоне. Эти задачи конструированы быть использованным для высокого контраста изображения с образцами имея малые фазовые сдвиги или рефракционные разницы, как тонкие волокна, жгутиков, ресничек, зерен, и очень малых частиц. Обычно ограниченные к более высоким задачам увеличения имея большие численные апертуры (флюориты и апохроматы), выполняют хорошо с очень тонкими образцами, но часто показывают реверсирование контраста когда толстые образцы изображены.
• BM (Bright Medium - High Negative Contrast) - часто упоминается как отрицательный фазовый контраст, цели BM создают яркий контур изображения на среднем сером фоне. Задачи БМ идеальны для визуального осмотра бактериальных жгутиков, Пучков фибрина, мельчайших глобул, а также для подсчета клеток крови.

Для того чтобы позволить микроскопист быстро определить задачи контраста участка, много изготовлений вписывают важные спецификации, как увеличение, численная апертура, коррекция длины пробки, etc., на внешнем стволе зелеными буквами. Зеленый буквенно-цифровой цветовой код служит для дифференциации целей фазового контраста от обычных объективов косого освещение, поляризация, DIC и флоуресценция , которые либо используют альтернативный цветовой код, либо стандартную черную надпись. В добавлении, задачи контраста участка имеют надписи на бочонке для того чтобы показать что задача конструирована для контраста участка и также соответствуя обозначения кольцевого канала. Ряд наиболее часто встречающихся объективных бочковых гравюр . Задачи контраста участка можно также легко определить путем держать задачу до яркого света и всматриваться через стекло для того чтобы наблюдать центральн-расположенным кольцом темной фазы.

Типичная серия фазовых контрастных задач, имеющих увеличивающуюся числовую апертуру и увеличение, представлена на рис 12. Как правило, при увеличении объективной числовой апертуры и увеличения фазовой пластинки ширина и диаметр фазовой пластины уменьшаются (а размер кольцевого зазора конденсатора увеличивается). Также проиллюстрировано на рис 12 приведены разрезные диаграммы, показывающие Основные понятия, лежащие в основе конструкции положительных и отрицательных фазовых пластин. Пластина с положительной фазой создает темный контраст и содержит частично поглощающую пленку, предназначенную для уменьшения амплитуды объемного волнового фронта. Кроме того, эта пластина содержит фазовый замедляющий материал, предназначенный для смещения (задержки) фазы дифрагированного света на 90 градусов. Отрицательная плита участка также содержит и материалы участка задерживая в развитии и частично поглощая. Однако в этом случае оба материала помещаются в круговое фазовое кольцо таким образом, что недиффрактированный объемный волновой фронт становится единственным затронутым видом и ослабляется и замедляется в фазе на 90 градусов.

Контрастность модулируется в фазовых задачах путем изменения свойств фазовой пластины, включая поглощение металлической пленки (или антибликовых покрытий), показатель преломления фазового замедляющего материала и толщину фазовой пластины. Большинство фазовых пластин, доступных у производителей, получают путем вакуумного осаждения тонких диэлектрических и металлических пленок на стеклянную пластину или непосредственно на одну из поверхностей линзы в объективе микроскопа. Роль диэлектрической пленки заключается в смещении фазы света, в то время как металлическая пленка ослабляет недиффрактированную интенсивность света. Некоторые производители используют несколько антибликовых покрытий в сочетании с тонкими пленками для уменьшения количества бликов и рассеянного света, отраженного обратно в оптическую систему. Если фазовая пластинка не сформирована на поверхности линзы, она обычно склеивается между последовательными линзами, которые находятся вблизи плоскости дифракции объектива. Толщина и показатели преломления диэлектрических, металлических и антибликовых пленок, а также оптических цементов тщательно подбираются для получения необходимого фазового сдвига между комплементарными (дифракционными) и сопряженными (объемными) областями фазовой пластины. В оптической терминологии фазовые пластины, которые изменяют фазу объемного света относительно дифрагированного света на 90 градусов (положительную или отрицательную), называются четвертьволновыми пластинами из-за их влияния на оптическую разность хода.

Фазовый Телескоп

Если кольцо конденсатора, расположенное в передней фокальной плоскости конденсатора подкачки, не находится в точном соответствии с неподвижной фазовой пластиной в объективе (которая расположена в центре вдоль оптической оси микроскопа), контрастный эффект, обеспечиваемый фазовыми контрастными оптическими системами, будет резко нарушен. Для обеспечения правильной работы микроскопа и максимального эффекта фазового контраста объективная задняя фокальная плоскость должна быть исследована с помощью конденсаторного кольца, чтобы убедиться, что микроскоп правильно выровнен. Эта задача может быть выполнена с помощью либо a телескоп участка, который можно ввести в одну из трубок замечания окуляра (вместо нормального окуляра), или объектив Bertrand построенный в собрание трубки окуляра микроскопа бинокулярное (или trinocular). Микроскоп Nikon Ti2 отличает внутренним объективом Bertrand который позволяет для кольца участка или быть визуализированным глазом или сразу на камере для точного выравнивания, также, как внешний модуль контраста участка для выполнять воображение контраста участка с задачами которые не имеют кольцо участка.

Фазовый Телескоп, также обычно называемый вспомогательным телескопом или вспомогательным микроскопом, состоит из простого двух или трех линзового телескопа аранжированный для того чтобы действовать как объектив и сочетание из окуляра миниатюрная оптическая система которая промежуточна между телескопом и микроскопом. Фокусное расстояние фазового телескопа колеблется примерно от 150 до 200 миллиметров, что позволяет устройству фокусироваться на задней фокальной плоскости объектива при вставке в одну из окулярных трубок микроскопа для наблюдения. Увеличенный вид объективной фокальной плоскости четко показывает пространственное расположение между кольцом конденсатора и объективным фазовым кольцом, когда фазовый телескоп правильно сфокусирован. При просмотре неподвижного фазового кольца в объективе оператор может затем выполнить настройку положения кольца конденсатора для выравнивания двух для наблюдения фазового контраста .

Микроскопы конструированные главным образом для замечания в контрасте поляризовыванного света или дифференциального взаимодействия часто имеют объектив Bertrand который включен в блок пробки замечания окуляра или промежуточную пробку которая введена между пробкой окуляра и телом микроскопа. Объектив Bertrand несколько более сложен, чем простой фазовый телескоп, и действует как релейная линза, передавая изображение фокальной плоскости объектива на плоскость промежуточного изображения микроскопа, расположенную в апертурной диафрагме окуляра. Таким образом, при линзе Бертрана, вставленной в оптический тракт микроскопа, объективная задняя фокальная плоскость (и выравнивание фазовой пластинки/конденсаторного кольца) может наблюдаться через окуляры микроскопа. На большинстве микроскопов, оснащенных линзой Бертрана, линза может вращаться в оптическом тракте и из него с помощью небольшого маховика механизма, расположенного под трубками окуляра. Более поздние модели микроскопов часто устанавливают объектив Bertrand в башенке вместе с объективами, которые изменяют коэффициент увеличения изображения. Регулировка сделана с небольшой ручкой которая обозначена Б или ПЭ-аш для положения объектива Bertrand, и 0 или некоторое другое число для объектива увеличения.

Как фазовый телескоп, так и объектив Бертрана должны быть оснащены механизмом регулировки фокуса, поскольку расположение задней фокальной плоскости объектива может изменяться с увеличением (а также рядом дополнительных факторов) и лежать на разных уровнях внутри микроскопа. Фокусировка типичного фазового телескопа осуществляется простым скручиванием глазной трубкидо тех пор, пока объективная задняя фокальная плоскость не будет резко сфокусирована. Аналогичным образом, большинство линз Бертрана в современных микроскопах оснащено фокусирующим диском, который позволяет оператору фокусировать комбинацию Бертран-линза-окуляр на фазовой пластине в объективе. При использовании согласованного набора объективов (парфокальных, с одинаковой оптической коррекцией и длиной трубки) положение задней фокальной плоскости должно оставаться по существу таким же, как при изменении увеличения, что уменьшает необходимость перефокусировки фазового телескопа или объектива Бертрана.

Выравнивание Микроскопа Контраста Участка

Прежде чем пытаться выровнять микроскоп для наблюдения фазового контраста, внимательно изучите прибор, чтобы убедиться, что все объективы содержат фазовые пластины и прочно установлены в носовой части. Задачи также должны быть последовательно упорядочены в их расположении на носовой части, от более низкого к более высокому увеличению, чтобы минимизировать частоту переключения между одним кольцом конденсатора и другим. Часто цели 10x и 20x разделяют общее кольцо конденсатора, как и цели 40x и 60x. Сильно исправленные задачи, как apochromats конструированные для погружения масла, часто имеют подобные численные апертуры и используют такой же кольцевой конденсатор над широкийа ассортимент увеличения (40x к 100x). Контраст участка низкой мощности (4x и 5x) обычно требует конденсатора качани-объектива и специализированного кольца конденсатора.

Кольцевые пластины конденсатора также должны быть расположены последовательно, начиная с кольца, предназначенного для более низких целей увеличения и продолжая до одного, предназначенного для самого высокого увеличения. Как правило, весь диапазон увеличения может быть покрыт тремя или четырьмя отдельными кольцами. Если используется универсальный конденсатор, установите наименьшее кольцевое увеличение (например, PhL или Ph1) справа от гнезда brightfield, а остальные пластины в последовательном порядке в соседних слотах. Часто, образец необходимо рассмотреть в brightfield или перед или после замечанием контраста участка, поэтому это расположение обеспечит легкую подачу работы.

представлены изображения смещенной задней фокальной плоскости объектива, а также после того, как кольцо конденсатора и фазовое кольцо были должным образом выровнены . Также показано на этом рисунке представлены соответствующие образы, которые появляются при наблюдении через окуляры , которые демонстрируют как образец появляется, когда микроскоп неровные и тщательно выравниваются в соответствии с процедурой, изложенной ниже.

Для выравнивания фазового контрастного микроскопа рекомендуется выполнить следующие шаги.

• Поместите ярко окрашенный образец на сцену и поверните 10-кратный фазовый контрастный объектив в оптический путь в режиме косого освещения . Сфокусируйте образец и закройте полевую диафрагму до тех пор, пока она не войдет в края поля обзора. Используя ручку регулировки высоты конденсатора, расположите конденсатор подкачки так, чтобы отдельные листья полевой диафрагмы находились в резком фокусе, и используйте основные ручки регулировки центрирования конденсатора, чтобы обеспечить центрирование полевой диафрагмы в поле зрения. Внимательно изучите конфигурацию микроскопа, чтобы убедиться, что освещение Köhler было достигнуто, и образец находится в резком фокусе.
• Извлеките запятнанный образец и установьте образец участка на этапе микроскопа. В тех случаях, когда целевой образец имеет только минимальные оптические различия пути (и может быть трудно визуализировать), выровнять микроскоп с образцом, известным для получения высокой контрастности в режиме фазового контраста. Вращайте револьверную головку конденсатора до тех пор, пока соответствующее кольцо не будет расположено в оптическом тракте ( Ph1 или эквивалент для цели 10x). Убедитесь, что цветовой код или надпись кольца конденсатора соответствует цветовому коду или надписи объекта. Изучите положение рычага диафрагмы апертуры конденсатора и переместите его в самое широкое положение диафрагмы (конденсаторы, предназначенные для фазового контраста, могут делать это автоматически).
• Если микроскоп оснащен объективом Bertrand, используйте регулятор thumbwheel, чтобы повернуть объектив на место. В качестве альтернативы снимите один из окуляров микроскопа и вставьте фазовый телескоп в смотровую трубу.
• При наблюдении через окуляры или фазовый телескоп отрегулируйте фокус линзы Бертрана или телескопной трубки фокуса глаза до тех пор, пока фазовая пластина в объективе не окажется в резком фокусе, и перекрытие между ярким изображением кольцевого конденсатора и темным материалом нейтральной плотности в фазовой пластине не станет очевидным. Во многих случаях микроскоп первоначально будет не выровнен, и изображение кольцевого слоя не будет точно накладываться на материал нейтральной плотности в фазовой пластине .
• Расположите центрирующие штифты (или винты) кольца конденсатора и отрегулируйте положение кольца с помощью пары отверток или соответствующих ручек до тех пор, пока оно не будет совпадать с объективной фазовой пластиной . Примечание: не пытайтесь отрегулировать положение кольца конденсатора с помощью главных центрирующих ручек конденсатора (обычно расположенных на монтажном кронштейне конденсатора, прикрепленном к микроскопу). Эти усилия, вероятно, не приведут к запланированному выравниванию кольцевого зазора конденсатора и, безусловно, поставят под угрозу условия освещения Köhler, которые должны были быть установлены ранее.
• Когда кольцо конденсатора правильно центризовано, кольцо света пропуская через конденсатор будет ослаблено нейтральным материалом плотности приложенным к объективной плите участка, уменьшая интенсивность изображения кольца. Поэтому, если кольцо конденсатора неправильно центрировано, рядом с материалом нейтральной плотности в объективной фазовой пластине появится яркий серповидный край. Если изображение затрубного пространства не укладывается в темный круг фазовой пластины, то либо конденсор находится вне фокуса (и освещение Келера не установлено), либо фазовый телескоп (или объектив Бертрана) не фокусируется на задней фокальной плоскости объектива. В некоторых случаях, даже когда фазовый телескоп (или линза Бертрана) и конденсатор подложки должным образом сфокусированы, кольцевое изображение конденсатора размыто и появляется из фокуса. Это может быть вызвано низкочастотной дифракцией от образца. Если это происходит, то извлеките образец от этапа и продолжите с выравниванием микроскопа.
• Если изображение кольцевого зазора конденсатора значительно отличается по размеру от изображения объективной фазовой пластины, проверьте, установлена ли в конденсаторе неправильная кольцевая пластина (наиболее вероятная причина). Другая возможность, если высокие задачи погружения масла численной апертуры используются, то что элемент объектива фронта конденсатора конструирован быть погруженным. В этом случае может быть трудно (или невозможно) наложить кольцо конденсатора на фазовую пластину без капли масла между линзой конденсатора и предметным стеклом микроскопа (и/или между объективом и скользящим покрытием).
• Когда кольцевое пространство конденсатора и объективная фазовая пластина находятся в правильном положении, изображение, должно появиться в фазовом телескопе или окуляре с линзой Бертрана на месте. В этот момент микроскоп правильно настроен для наблюдения за образцом с фазовым контрастным освещением.
• Замените телескоп участка с окуляром, или поверните объектив Bertrand из оптически тропа, и расмотрите образец. Фон должен быть нейтрального серого цвета (в зависимости от нейтральной плотности пластины объективной фазы)с образцом, видимым в высокой контрастности.

Как только микроскоп был выровнен для контраста участка, он вообще будет держать свою центрацию для значительного числа объективных/кольцевых изменений, но должен быть проверен периодически для обеспечения правильного выравнивания. Если микроскоп начнет выходить из строя, то изображения, появляющиеся в окулярах (или на мониторе компьютера), будут все больше походить на те, которые наблюдаются при ярком освещении поля.

Большинство производителей микроскопов предоставляют зеленый интерференционный или абсорбционный фильтр со своими вспомогательными наборами фазового контраста, поскольку фильтр будет производить монохроматический свет с той же длиной волны, используемой для первоначальной калибровки объективных фазовых пластин. В результате, контраст увеличен Когда фильтр введен в оптически тропу (обычно между объективом конденсатора освещения и диафрагмой поля). Большинство коммерческих фазовых пластин предназначены для получения фазовых сдвигов четверти длины волны в зеленой (550 Нм) части спектра видимого света. Теоретически, если вместо монохроматического света использовать белый свет, то угасание интерференции не будет полным для всех цветов, и контраст будет страдать. Это ограничение особенно важно, если ахроматические цели, которые корректируются для хроматической аберрации только в зеленой области, используются для наблюдения фазового контраста или записи изображения. Однако при нынешних сильно откорректированных флюоритовых и апохроматических задачах разница в контрасте зачастую оказывается незначительной, а значит, и несущественной.

Ключом к успешной визуализации с фазовым контрастным освещением является правильное выравнивание микроскопа и обеспечение равномерного распределения достаточно тонких образцов внутри установочной среды на предметном стекле микроскопа. Изображения, сделанные с чрезвычайно толстыми образцами, часто страдают от размытия вне фокуса и артефактов инверсии контраста, которые могут быть трудно интерпретировать. Если микроскоп используется в течение длительного периода времени, периодически проверяйте заднюю фокальную плоскость объектива, чтобы проверить выравнивание кольца конденсатора с фазовой пластиной в объективе.

Выводы

Фазовый контраст является отличным методом повышения контрастности тонких, прозрачных образцов без потери разрешающей способности и зарекомендовал себя как ценный инструмент в изучении динамических явлений в живых клетках. До введения фазовых контрастных оптических систем клетки и другие полупрозрачные образцы были визуализированы в яркой полевой микроскопии с помощью методов искусственного окрашивания. Хотя эти образцы можно наблюдать и записывать с помощью темнопольного и косого освещения или с помощью расфокусировки микроскопа косого освещение, эта методология оказалась ненадежной в предоставлении критической информации о клеточной структуре и функции.

Метод фазового контраста широко применяется в биологических и медицинских исследованиях, особенно во всех областях цитологии и гистологии. Таким образом, методология используется для изучения живых клеток, тканей и микроорганизмов, которые прозрачны при ярком освещении поля. Фазовый контраст позволяет легко визуализировать внутренние клеточные компоненты, такие как мембраны, ядра, митохондрии, веретена, митотический аппарат, хромосомы, аппарат Гольджи и цитоплазматические гранулы как из растительных, так и из животных клеток и тканей. Кроме того, фазовая контрастная микроскопия широко применяется для диагностики опухолевых клеток и роста, динамики и поведения большого количества живых клеток в культуре. Разработаны специализированные дальнодействующие фазовые контрастные оптические системы для инвертированных микроскопов, применяемых для исследования культуры тканей. Другими областями в биологической сфере, которые извлекают выгоду из наблюдения фазового контраста, являются гематология, вирусология, бактериология, паразитология, палеонтология и морская биология.

Промышленные и химические применения для контраста участка включают исследования минералогии, кристаллографии,и морфологии полимера. Бесцветные микрокристаллы, порошки, твердые частицы твердых частиц и кристаллические полимеры, имеющие показатель преломления, который лишь незначительно отличается от показателя преломления объемной иммерсионной жидкости, часто легко наблюдаются с помощью фазовой контрастной микроскопии. В действительности, количественная рефрактометрия часто использована для того чтобы получить значения показателя преломления и для целей идентификации. Другие коммерческие продукты тщательно изученные методами контраста участка оптически включают глины, сала, масла, мыла, краски, пигменты, еду, лекарства, ткани, и другие волокна.

Микроскопия контраста участка падающего света, хотя в большинстве вытесненный методами дифференциального контраста взаимодействия, полезна для рассмотрения поверхностей, включая интегральные схемаы, кристаллические вывихивания, дефекты, и литографии. Хорошим примером являются дефекты укладки кремниевых эпитаксиальных пластин, которые имеют огромное значение для полупроводниковой промышленности. В системах фазового контраста отраженного света изображение освещающего кольца проецируется в заднюю фокальную плоскость объектива, где обычно расположена фазовая пластина. Кроме того, фазовая пластина не расположена внутри объектива, но изображение задней фокальной плоскости формируется вспомогательной линзовой системой, которая позволяет избежать отражений и рассеяния, генерируемых фазовой пластиной. Следует отметить, что в отраженной световой фазовой контрастной микроскопии фазовые различия возникают из-за рельефа на поверхности образца, а не из-за фазовых градиентов внутри образца.

Уменьшение количества гало-и затеняющих артефактов остается основной проблемой в фазово-контрастной микроскопии. Аподизированные фазовые пластины полезны для уменьшения выраженности гало, и специализированные системы с переменным фазовым контрастом могут быть точно настроены для управления этими эффектами с целью оптимизации качества изображения и точности информации, полученной с помощью метода. Существует также значительный интерес к разработке усовершенствованных систем фазового контраста, обеспечивающих точные измерения фазовых образцов, имеющих большие оптические разности хода, а также комбинированные наблюдения с другими методами усиления контраста. В частности, фазовый контраст часто используется с флуоресцентной визуализацией для определения местоположения флуорофоров и показывает перспективность повышения контраста в сканирующей оптической микроскопии.