CRISPR-Cas-система

Говоря очень кратко:

• CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats, участки геномов представителей бактерий и архей, обладающие высокой степенью повторов
• CRISPR-Cas-системы обеспечивают адаптивный иммунитет бактерий и архей за счёт комплементарного связывания с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas.

А теперь давайте разбираться :)

Устройство CRISPR-Cas-системы

CRISPR/Cas системы состоят из CRISPR-кассеты и прилегающего к ней кластера генов cas.

CRISPR-кассеты — блок прямых взаимокомплементарных последовательностей ДНК, в котором последовательно чередуются повторы (обычно 24–48 пар нуклеотидов).

Эти повторы перемежаются спейсерами.

Спейсеры (от англ. spacer — «разделитель») — участки некодирующей ДНК, расположенные между тандемно повторяющимися генами.

Спейсеры идентичны различным участкам ДНК того, кто когда-либо проникал в эту клетку или в родительские клетки (из которых получилась эта клетка). Число таких спейсеров в клетке может варьироваться от единиц до сотен.

Итак, мы разобрали строение, теперь перейдём к функциям!

Функции CRISPR-Cas-системы

Работа CRISPR-Cas-системы, обеспечивающей приобретение устойчивости и последующую защиту бактерий от бактериофагов, обуславливается двумя процессами: CRISPR-адаптацией и CRISPR-интерференцией.
Давайте разберём оба процесса по-отдельности: что, как и зачем?

CRISPR-адаптация

CRISPR-адаптация – это первый этап работы CRISPR-Cas-системы. Именно на этом этапе и происходит формирование бактериального «иммунитета» за счёт встраивания в CRISPR-кассету небольших фрагментов ДНК бактериофага.

В этом деле нам и пригодятся белки Cas, которые встраивают спейсеры и уничтожают агентов с идентичными последовательностями.

Сейчас мы рассмотрим «первую» функцию белков Cas— встраивание спейсеров в ДНК последовательность, что и лежит в основе адаптации.

Как идёт процесс?

В процессе встраивания в CRISPR-кассету нового спейсера особую роль играет промоторная область CRISPR-кассеты, называемая лидером или же лидерной последовательностью.

Если в бактерию или архею, снабженную CRISPR-системой, проникает вирус, включается адаптационный функциональный модуль системы: специфические Cas-белки — у всех систем это как минимум Cas1 и Cas2 — вырезают из чужака понравившиеся фрагменты.

Выбор фрагмента ДНК фага для последующего встраивания в качестве спейсера в CRISPR-кассету происходит, только если перед ним расположена специальная последовательность, называемая PAM-мотивом (protospacer-adjacent motif). Кроме того, предполагают, что PAM могут служить маркерами, позволяющими CRISPR-системе отличить собственную ДНК от чужеродной.

После выбора фрагмента Cas-белки встраивают его в CRISPR-кассету, притом всегда с одной стороны — у лидерной последовательности. Так образуется новый спейсер, а заодно с ним — и новый повтор.

Благодаря всему этому процессу клетка «запоминает» врагов, которые когда-либо проникали в неё. Сформировавшийся комплекс называют адаптивным.

Дополнительно:
Встраивание нового спейсера происходит рядом с ближайшим к лидеру повтором. Подобный механизм адаптации позволяет определять хронологическую последовательность событий

CRISPR-интерференция

Как уже упоминалось ранее, Cas-белки встраивают спейсеры и уничтожают агентов с идентичными последовательностями— протоспейсерами.

Протоспейсер - участок ДНК фага, соответствующий CRISPR-спейсеру устойчивой клетки, а так же содержащий однонуклеотидные замены, нарушающие комплементарное соответствие протоспейсера и спейсера

Теперь мы поговорим о «второй» функции белков Cas, а именно уничтожение агентов с идентичными последовательностями.

Ещё немного теории:

Cas-белки, уничтожающие этих самых агентов с протоспейсерами, называют эффекторными. Они формируют комплекс, транспортирующий и встраивающий фрагменты ДНК в CRISPR-кассету.

В молекулярной биологии и биохимии под термином эффектор или эффекторная молекула обычно понимается малая небелковая молекула, которая селективно связывается с теми или иными белками и регулирует их биологическую активность.

Интерференция чужеродной ДНК или РНК – обеспечивается за счет взаимодействия крРНК и комплекса Cas-белков.

CRISPR кассета транскрибируется, как единый РНК предшественник, который затем процессируется с образованием набора коротких фрагментов РНК (крРНК).

Как идёт процесс?

1) С CRISPR-кассеты считываются отдельные крРНК, состоящие из спейсера, который окружен фрагментами повтора

2) крРНК и белки Cas, продукты генов cas, образуют комплекс, узнающий последовательность, комплементарную спейсеру крРНК (протоспейсер) в составе ДНК-мишени. Такой комплекс называют эффекторным.

3) На заключительном этапе мишень разрезается.

Хмм… А почему бы нам это не использовать?

Подумали учёные и… начали корректировать геномы других организмов (!)

Но не всё так просто. Потребовались годы, чтобы найти то самое решение, за которое ныне вручили Нобелевскую премию по химии. А именно CRISPR-Cas9.

Для редактирования генома требовалось лишь разместить на векторе ген белка Cas9 и CRISPR-кассету, где спейсеры сделать идентичными местам генома, которые нужно изменить. Меняя число и тип спейсеров, можно модифицировать сразу несколько разных участков генома.

Вектор (в генетике и молекулярной биологии) — молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала внутрь клетки, в том числе в клетку живого многоклеточного организма in vivo

Получилась простая и, что немаловажно, дешевая двухкомпонентная система: ген cas9 и CRISPR-кассета транскрибируются в клеточном ядре выбранного организма, CRISPR-транскрипт нарезается на отдельные sgРНК (однонаправленная РНК), которые объединяются с белками Cas9 и ищут цель.

Когда sgРНК находит комплементарный участок в геноме организма, Cas9 разрезает обе цепи ДНК. Всё, работа CRISPR-системы на этом окончена. Эту CRISPR-Cas9-систему и назвали «генетическими ножницами».

Лауреатами Нобелевской премии по химии 2020 года стали Эммануэль Шарпантье (Emmanuelle Charpentier) и Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna), премия присуждена им за развитие метода редактирования генома CRISPR-Cas.

Спасибо за внимание! Изучайте биологию — в ней, ключ к изменению наших жизней!

Источники информации:
http://www.bioclass.ru/files/def17/reutova.pdf
http://iitp.ru/upload/content/1261/GAA_disser.pdf
https://biomolecula.ru/articles/prosto-o-slozhnom-crispr-cas
https://elementy.ru/nauchno-populyarnaya_biblioteka/432418/Umnye_nozhnitsy_dlya_DNK
https://biomolecula.ru/articles/a-ne-zamakhnutsia-li-nam-na-izmenenie-genoma
J. A. Doudna, E. Charpentier. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096-1258096
Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, et. al.. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6, 363-372