Питательные среды

В микробиологии.

Сегодня мы поговорим про то, без чего микробиологию невозможно представить, а именно — о питательных средах. (Про биотехнологию мы поговорим позже, в отдельной статье, т. к. материалов там в разы больше.)

Состав сред

Питательные среды должны содержать в себе:

Источник углерода

Большинство бактерий и все грибы — гетеротрофы, как следствие, они нуждаются в органическом источнике углерода, обычно в качестве такого источника выступают глюкоза, лактоза или соли органических кислот, но бактерии могут использовать в качестве источника углерода большее количество веществ, включая жирные кислоты, спирты, белки, углеводы, метан, некоторые могут даже использовать целлюлозу. Цианобактерии являются автотрофами и поэтому дополнительного источника углерода в среде не требуют.

Источник азота

Он может быть органического происхождения: аминокислоты, пептиды, белки — и неорганического происхождения: соли аммония и нитраты. Аминокислоты добавляются в среду в виде частично переваренных белков-пептонов.

Факторы роста — витамины

Нужны не всегда. Для нормального роста требуются лишь следовые количества витаминов, которые содержащиеся в компонентах природного -неопределённого- происхождения.

Минеральные соли

Чаще всего микроорганизмам для роста требуются катионы кальция, калия, натрия, железа, магния, аммония и хлорид-, фосфат-, сульфат-анионы.

Вода

Несмотря на то, что она питательным веществом не является, она нужна всем живым организмам.

На данный момент существует огромное множество различных питательных сред. Их можно разделить на две большие группы: среды, основанные на природных компонентах -имеющие непостоянный, неопределенный состав, и синтетические среды, состав которых выверен до миллиграмма.

Среды, которые можно приготовить в своей домашней лаборатории, в основном относятся к первой группе. Но есть и несколько относительно простых синтетических сред, с которыми могут справиться те, у кого лаборатория уже на уровне «продвинутого пользователя».

Также среды можно разделить по назначению. Обычно их делят на универсальные, дифференциально-диагностические и селективные, но в начале, для удобства, я буду придерживаться иной классификации. В последующем, мы вернёмся к вышеупомянутой.

Итак, по назначению, мы разделим среды следующим образом:

• для выделения, культивирования и хранения штаммов грибов

• для выделения, культивирования и хранения штаммов бактерий.

Штамм — культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника (организм животного, воздух, почва и так далее).

А теперь по порядку про первую группу сред.

Грибы — это эукариоты, использующие гетеротрофный тип питания (потребляют готовые орг. вещества), значит, среды для их культивирования должны быть богаты необходимыми грибу для роста органическими веществами. Грибами особенно ценятся углеводы, но не стоит забывать про минеральные соли и другие приведённые выше компоненты, в частности, про воду. Некоторые среды содержат множество разных солей, а в среды, не содержащие в своём составе соли, иногда рекомендуют добавлять раствор микроэлементов или просто используют водопроводную воду, что в условиях домашней лаборатории является оптимальным вариантом.

В случае с грибами среды можно разделить по родам, которые на этой среде могут вырасти. Но если вы посадите гриб из одного рода на среду, предназначенную для другого, это не значит, что он там не вырастет, его рост может быть значительно замедлен. Также от выбора питательной среды может зависеть пигментация и структура мицелия.

Поэтому при выделении штамма стоит делать засевы на несколько питательных сред, которые стоит подбирать, исходя из предполагаемых потребностей гриба. К примеру, если гриб рос на яблоке, то ему, скорее всего, подойдёт среда, богатая углеводами.

Иногда при выделении грибов можно использовать отвар или вытяжку из естественного субстрата, на котором рос гриб, в случае с грибами-фитопатогенами(патогены растений) — из растения-хозяина.

Так, на 1 л воды берут 100 г свежих или 50 г высушенных органов питающих гриб растений. Массу измельчают, кипятят 1 час, восстанавливают первоначальный объём и фильтруют, после чего добавляют 2-2,5% агара.

Для содержания музейных штаммов(какие-либо экземпляры, которые консервируют и хранят для того чтобы использовать в дальнейшем) используют бедные простыми углеводами, крахмальные или целлюлозные среды, некоторые виды (сапрофиты) лучше сохраняются на стерильном природном материале, к примеру, грибы рода Cytospora.

Также хотелось бы отметить немаловажный фактор, от которого в некоторых случаях будет зависеть, вырастет у вас на среде гриб или бактерии, — это pH. Грибы, как правило, любители слабокислой среды, оптимальный показатель для них— 5,3-5,6 (а для дрожжей вообще 4,5-5,0), такая кислотность способна ингибировать рост бактерий, которые иногда могут «забить» гриб.

К средам, применяемым для культивирования грибов, относятся:

• Картофельный агар,
• Картофельно-глюкозный агар,
• Агар Сабуро (бульон Сабуро),
• Агар Чапека (бульон Чапека),
• Морковный агар,
• Зерновой агар,
• Овсяный агар,
• Черносливиный агар,
• Крахмально- аммиачный агар

и так далее.

Здесь приведены среды, которые вполне реально приготовить в домашних условиях, прописи всех приведённых здесь сред вы найдёте в описании к посту в формате pdf-документа.

С бактериями всё менее однозначно, существует огромное множество бактерий с разными типами питания, чего только стоят железобактерии. Поэтому и сред для культивирования бактерий существует во много раз больше, чем для грибов.

pH бактерии, в отличие от грибов, предпочитают нейтральный или слабощелочной 7,0-7,5 (хотя тут тоже в зависимости от вида, но в общем, данная тенденция прослеживается).

Возвращаясь к приведённой выше и опущенной мной стандартной классификации сред, замечу, что для бактерий данная классификация как раз и предназначена.

Классификация питательных сред для бактерий

Селективные — растёт только определённая группа бактерий, рост остальных слабый или подавляется.

Примером таких сред являются солевые среды, которые содержат достаточно высокие концентрации NaCl или других осмотиков, в присутствии которых способны расти только бактерии рода Staphylococcus, рост других бактерий ингибируется.

Дифференциально-диагностические — в большинстве случаев содержат какой-либо индикатор, который помогает определить бактерию по цвету окрашивания её колоний и участков среды вокруг них, или, если мы говорим про жидкие среды, по окрашиванию раствора. Обычно действие данных сред основано на ферментации бактерией какого-либо углевода и выделении ею при этом специфических метаболитов, на которые реагирует индикатор. Например, среда Эндо: входящая в состав среды лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид, в свою очередь, высвобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция сильно выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.

Также есть среды, которые не содержат индикаторов, но некоторую дифференциальную функцию всё-таки выполняют, как пример — желточный агар: колонии бактерий, выделяющих лецитиназу, окружены зоной помутнения из-за ферментации лецитина, и наоборот, бактерии, не выделяющие этот фермент, ничем не окружены.

Пример, с молочным агаром: колонии бактерий, выделяющих протеолитические ферменты, окружены зоной просветления из-за разрушения казеина.

Универсальные среды — как правило, содержат в себе компоненты сложного и непостоянного состава, удовлетворяющие потребности многих групп микроорганизмов. Обычно используются для первичного выделения микроорганизмов.

Среды для культивирования бактерий:

• Глюкозо-пептонный агар (если агар не добавлять, будет бульон),
• Мясо-пептонный агар,
• Желточный агар,
• Желточно-солевой агар,
• Молочный агар,
• Молочно-солевой агар,
• Агар Эндо,
• Агар Левина,
• Бобовый агар,
• Среда Чаплина-Баренса.

Прописи всех сред находятся в приложенном к посту документе.

Почти все среды могут быть жидкими (так называемые бульоны). Жидкие среды применяются для культивирования и получения культуральных фильтратов. По характеру роста на жидкой среде можно судить о некоторых свойствах организма.

Также, хочется отметить, что ничего не ограничивает ваши эксперименты!

Среды могут быть сварены из самых разных и доступных ингредиентов (грибы вообще, по-моему, везде вырастут).

Приготовление и розлив питательных сред

Готовить среды удобнее в колбе Эрленмейера и в лабораторных банках (это не принципиально).

После добавления всех компонентов среду ставим в автоклав, стерилизуем и затем разливаем по чашкам Петри, соблюдая асептику и антисептику.

В том случае, если вам необходима среда в пробирках или каких-либо других культуральных емкостях, следует сначала довести среду до готовности (растворения всех компонентов, включая агар, если среда плотная) после, разлить ее по пробиркам и в пробирках уже стерилизовать.

После розлива и застывания среды в чашках Петри при комнатной температуре зачастую, можно столкнуться с образованием конденсата в чашках, его стоит по возможности убирать.

При перемещении чашек в термостат, непосредственно в термостате необходимо их просушить то есть, перевернуть чашки вверх дном и открыть так, чтобы среда смотрела вниз. Такая просушка может длится до получаса.

Ну и напоследок держите фото Penicillium italicum.

На этом всё, ждите новых статей и прочитайте предыдущую про обустройство домашней лаборатории, если вы ещё её не читали. До новых встреч!