«ПТИЧКУ ЖАЛКО!»: ОПУХОЛЕВЫЕ МОДЕЛИ ОРГАНИЗМЕННОГО УРОВНЯ

Автор: Полина Поцелуева

Администратор: Виктория Миргородская

Редактор: Анастасия Иштокина

Фактчекер: Герман Киселёв

Верстальщик: Анастасия Алексеева

Модель – это физический или абстрактный образ моделируемого объекта, удобный для проведения исследований и позволяющий адекватно отображать интересующие исследователя свойства и характеристики объекта.

Модели в биологии применяются для воссоздания биологических структур, функций и процессов на разных уровнях организации живого: от молекулярного до популяционно-биоценотического.

Что исследуют учёные и какие модели для этого у них есть

Усилия учёных всего онкологического мира используются в нескольких векторах:

1. Выяснение сущности злокачественного новообразования: почему возникает заболевание (чтобы найти методы профилактики и/или раннего выявления в группах риска) и как оно протекает (чтобы спрогнозировать состояние пациента);

2. Выработка системы мероприятий ранней диагностики заболеваний;

3. Разработка противоопухолевых препаратов, что включает в себя обнаружение и выделение биомаркеров-мишеней, оптимизацию структурных компонентов, определение переносимости и токсичности нового препарата и, конечно, его эффективности.

Для решения каждой из этих задач опухоль необходимо рассмотреть с разных точек зрения: от молекулярной биологии, биохимии, клеточных культур и трехмерных моделей органоидов, первичных опухолевых линий, животных и ксенотрансплантатов вплоть до компьютерных моделей и анализа данных пациентов. Мы остановимся лишь на одном блоке и далее рассмотрим модели организменного уровня.

Модели in vivo. Знакомимся ближе

Модель «in vivo» представляет собой целый живой организм животного и связанные с ним материалы, которые могут с тем или иным успехом имитировать человеческое тело со всеми взаимосвязанными физиологическими и патологическими процессами. Эксперименты на моделях организменного уровня являются связующим звеном между таковыми на клеточных линиях и клиническими исследованиями.

Преимущества моделей in vivo:

1. Воспроизведение возникновения и развития болезни.

При определенных условиях возникновение и развитие болезней животных аналогично этим процессам в организме человека, а животные имеют сходную с людьми анатомию, физиологию и наследственность. Следовательно, можно изучать развитие опухоли в физиологических условиях, где она реализует все свои hallmarks, а именно модель in vivo:

– позволяет отследить развитие новообразований на этапе метастазирования;

– создает условия изучения опухоли без отрыва от её микроокружения;

– обладает большей точностью прогноза эффективности применения различных видов терапии.

2. Создание аватаров пациентов, позволяющих подбирать терапевтический режим индивидуально для каждого больного

Недостатки моделей in vivo:

1. Отсутствие «идеальной» модели in vivo, так как каждая из них также обладает собственными достоинствами и недостатками (об этом мы поговорим немного позже).

2. Сложность воссоздания внутриопухолевой гетерогенности, главным образом – клонального и фенотипического разнообразия опухолевых клеток, наблюдаемого в реальной клинической практике.

NB: данный недостаток в большей степени устраняется в моделях PDX (patient-derived xenograft – ксенотрансплантаты из клеток опухоли пациентов), но модель есть модель, и 100% сходства с реальной системой пока добиться не получается.

3. Трудность реализации комплексной структуры и клеточного состава микроокружения опухоли, что необходимо для изучения, например, лекарственной резистентности.

NB: однако ключевой компонент микроокружения опухоли в виде клеток иммунной системы человека и их взаимодействие с опухолью может быть исследовано с помощью in vivo модели гуманизированных мышей.

4. Техническая сложность создания ксеногенных, генно-инженерных и гуманизированных моделей, что требует навыков микрохирургии и генетического редактирования.

5. Высокая стоимость, опосредованная трудоёмкостью и длительностью реализации этих моделей, а также содержанием в лабораториях.

5. Этические трудности и ограничения, установленные «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях».

Классификация и особенности моделей in vivo

Классифицировать модели in vivo можно по разным признакам.

По объекту исследования:

– крупные животные модели (свиньи, собаки, кролики, обезьяны);

– мелкие животные модели (мыши, крысы, рыбы Danio rerio, мушки Drosophila melanogaster)

Всё, что касается особенностей наиболее часто используемых животных, выступающих в качестве моделей in vivo, собрано в таблице 1.

По состоянию иммунной системы животной модели (в первую очередь относится к мышиным моделям):

– иммунокомпетентные животные,

– иммунодефицитные животные,

– гуманизированные животные.

Помимо исследований на иммунокомпетентных животных (то есть с неизменённой иммунной системой), популярностью у учёных пользуются животные с различными типами иммунодефицита: отсутствием Т-лимфоцитов (nude-модели), Т- и В-лимфоцитов и с нарушением функции NK-клеток. Например, на моделях nude-мышей с высокой точностью можно прогнозировать резистентность и чувствительность опухоли, исследовать её биологические свойства, однако отсутствие иммунных клеток затрудняет рассмотрение взаимодействия опухоли и её микроокружения, а также влияния иммунного звена на прогрессирование заболевания.

Таблица 1.

Микроокружение опухоли играет значительную роль в ответе на терапию и развитие опухоли. Изучить его можно с использованием модели ex vivo с органоидами и фрагментами опухоли, но для того, чтобы эффективность препаратов на доклиническом этапе воспроизводилась при внедрении в клиническую практику, важно «ввести в игру» микроокружение опухоли.

Эта проблема решается с помощью гуманизированных, то есть имеющих ключевые компоненты иммунной системы человека, животных ­– мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом или с дефектной рекомбинацией генов антител и рецепторов Т-клеток, нарушающих адаптивный и врожденный иммунитет. Таким мышам сначала приживляют компоненты иммунной̆ системы человека путем введения клеток в кровоток и после оценки их жизнеспособности подсаживают ксенотрансплантаты (об этом далее). Возможна также единовременная инокуляция опухолевых и иммунных клеток, например, посредством инъекции суспензии из биопсийного материала и гемопоэтических клеток после их предварительной коинкубации. Данные модели подходят для изучения взаимодействия опухоли и иммунной системы, оценки роли иммунных компонентов в опухолевой прогрессии и анализа эффективности иммунотерапии.

По особенностям «внедрения» заболевания:

– сингенные,

– ксеногенные,

– генно-инженерные модели.

У всех животных, как и у человека, могут возникать спонтанные опухоли, особенно при индукции теми или иными канцерогенами. Из спонтанно возникших опухолей создаются линии опухолевых клеток путём выделения и культивирования в искусственных питательных средах. Далее опухолевые клетки трансплантируют в организм. В зависимости от происхождения опухолевой клеточной линии организменная модель может быть сингенной или ксеногенной.

Сингенная модель – это организм с внедрёнными опухолевыми клетками, принадлежащими инбредной линии (, клетки получают от спонтанных индуцированных канцерогеном мышиных опухолей «чистокровных», специально выведенных линий, BALB/c, C57BL/6 и FVB, затем культивируют in vitro и вводят особям той же линии).

Сингенные модели широко применяются для моделирования опухолевого заболевания из-за их относительной простоты. Однако их большим недостатком является отсутствие человеческого материала в эксперименте, что усложняет трансляцию результатов в доклинические и клинические исследования.

Ксеногенная модель образуется в результате имплантации чужеродных опухолевых агентов (клеточные культуры, клетки первичной опухоли и фрагменты опухолевой ткани) в организм экспериментального животного – в основном иммунодефицитным мышам.

Ксенотрансплантат, полученный из клеточной линии (cell line derived xenograft, CDX), считается «золотым стандартом» доклинических исследований при изучении роста опухоли. Модель CDX имеет несколько общих характеристик с опухолями человека, поскольку представляет собой васкуляризированную трехмерную опухоль, растущую в живом организме, которая содержит клетки стромы и внеклеточный матрикс с собственными толерантностью к лекарственным агентам и метаболизмом.

К преимуществам использования CDX относятся экономичность, простота, неограниченный запас материала, воспроизводимость результатов (так как животные линии и клеточные линии, как правило, стандартизированы и инбредны) и отсутствие этических загвоздок, связанных с применением тканей животных и человека.

Однако используемые клеточные линии не всегда воспроизводят молекулярные особенности и фенотип первичных опухолевых клеток, так как при многократном пассировании (Пассирование клеток – микробиологическая операция, осуществляемая с клетками и клеточными линиями при посеве их на субстрат для дальнейшей культивации. – Прим. автора) наблюдаются вариации в хромосомной организации, маркерах дифференцировки, экспрессии генов, кариотипе и скорости роста клеточных линий. Кроме того, линии опухолевых клеток не могут точно имитировать особенности роста аналогичных in vivo из-за состава питательных сред. К недостаткам использования модели CDX можно отнести и нарушение фармакокинетики, отсутствие гетерогенности клеток, иммунной системы и микроокружения, характерного для опухолей человека.

Ксенотрансплантаты можно получить и из клеток опухоли пациентов (patient-derived xenograft, PDX), а также из их циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Модели PDX, получаемые из опухолевой ткани пациента, создаются при очень низком количестве пассажей, что с большей вероятностью сохраняет исходные характеристики первичной опухоли. К этим важным характеристикам относят: гетерогенность клеток, экспрессия клинически значимых молекулярных маркеров, злокачественные генотип и фенотип, структура опухоли и сосудистая сеть. Данные модели позволяют сохранть естественное микроокружение опухоли и предоставляют возможность для персонализации терапии и трансляции результатов непосредственно на пациента.

Однако PDX имеют свои ограничения: техническая сложность и дороговизна создания таких моделей, отсутствие «включения иммунной системы» (напомним, что PDX реализуется у мышей с иммунодефицитом). Чтобы скорректировать последний недостаток, возможно использовать гуманизированных мышей, что однако, еще больше усложняет технологию. Кроме того, взаимодействие микробиома и опухоли даже в таких сложных модельных организмах слишком отличается от такового у человека.

Идём дальше. Принципиально отличаются от предыдущих генно-инженерные модели (genetically engineered models, GEM). Их создают с помощью генетических модификаций на начальных этапах эмбриогенеза, используя плазмидные конструкции. Возможны вставка онкогена под контролем тканеспецифического промотора (например, промотора MMTV, специфического для молочной железы) или нокаут опухолевых генов-супрессоров (например, TP53). GEMs демонстрируют прогрессирование опухоли de novo, как правило, в иммунокомпетентном опухолевом микроокружении.

Это позволяет моделировать комплексное взаимодействие опухолевых клеток, стромы и иммунной системы на всех стадиях опухолевого роста и метастатического каскада. Важное преимущество GEM в том, что с помощью различных препаратов, таких как эстроген, тамоксифен, доксициклин и тетрациклин, можно влиять на уровень экспрессии онкогенов и онкосупрессоров в организме генно-инженерного животного. В последние годы были разработаны GEM для РМЖ, поджелудочной железы, легких, колоректального рака, гепатоцеллюлярного рака, меланомы и др.

К основным ограничениям GEMs относят:

• Нацеленность на определенные группы генов, которые не отражают гетерогенность опухоли человека;

• Дороговизна и трудоёмкость процессов создания GEMs, часто требующие длительного периода разработки перед валидацией;

• Низкая частота распространения метастазов и принципиально иные закономерности процесса метастазирования, которые часто не соответствуют органотропности, наблюдаемой в опухолях человека;

• Эволюция опухолей у животных проходит медленно и претерпевает спонтанные изменения;

• Все та же проблема иной биохимии, физиологии и анатомии по сравнению с людьми.

Подводя итоги

● Экспериментальные системы in vivo для изучения онкологических заболеваний человека включают в себя целые организмы, такие как мушки Drosophila melanogaster, рыбки Danio rerio и генно-инженерные модели мышей, крыс, свиней и других крупных животных, ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX) и из клеточных линий (CDX).

● Важной характеристикой in vivo систем также выступает состояние иммунной системы модельного организма (иммунокомпетентные, иммунодефицитные и гуманизированные животные).

● Перечисленные модели в большей или меньшей степени являются основой для изучения биохимических и патогенетических путей развития опухолей, для разработки и тестирования новых препаратов и выявления их токсичности.

● Совокупная информация, полученная в результате исследований на разных моделях, помогает более детально понять тонкости канцерогенеза и эффективность лекарственной терапии.

Источники:

1. Li Z, Zheng W, Wang H, et al. Application of Animal Models in Cancer Research: Recent Progress and Future Prospects. Cancer Manag Res. 2021;13:2455-2475. Published 2021 Mar 15. doi:10.2147/CMAR.S302565

2. Sajjad H, Imtiaz S, Noor T, Siddiqui YH, Sajjad A, Zia M. Cancer models in preclinical research: A chronicle review of advancement in effective cancer research. Animal Model Exp Med. 2021;4(2):87-103. Published 2021 Mar 29. doi:10.1002/ame2.12165

3. Breitenbach M, Hoffmann J. Editorial: Cancer Models. Front Oncol. 2018;8:401. Published 2018 Oct 3. doi:10.3389/fonc.2018.00401

4. Бокова У.А., Третьякова М.С., Щеголева А.А., Денисов Е.В. Модельные системы in vivo для исследований в онкологии. Успехи молекулярной онкологии. 2023;10(2):8-16.