Проект ученых ИФМ РАН по развитию мягкой рентгеновской микроскопии
Одним из победителей конкурса РНФ на поддержку междисциплинарных исследований стал проект под руководством Ильи Малышева, кандидата физико-математических наук, научного сотрудника ИФМ РАН. Исследование посвящено развитию мягкой рентгеновской микроскопии и ее интеграции в инструментарий для клеточно-биологических исследований и будет проводиться в 2022-2025 годах. Рассказываем подробнее, что изучают ученые и почему этот метод востребован в клеточной биологии.
«Современные методы оптической микроскопии с супер-разрешением позволяют превысить дифракционный предел и визуализировать субклеточные структуры биологических образцов с разрешением порядка 50-100 нм (STED, STORM и др. методы). Потенциально с их помощью можно наблюдать не только статичные, но и динамические процессы, хотя сейчас эта возможность реализована не в полной мере – для получения данных необходимо гораздо больше времени, чем протекает сам процесс. Есть и другие ограничения. Например, флуоресцентные методы позволяют наблюдать только те структуры и молекулы, которые несут на себе флуоресцентную метку, но с их помощью нельзя увидеть остальную часть образца, своеобразный биологический «контекст». Электронная микроскопия обеспечивает разрешение до 1нм. Однако с ее помощью нельзя прижизненно, в динамике наблюдать клеточные биологические образцы. Кроме того, из-за сильного рассеяния электронов на образце возможно наблюдение только тонких до 0.5 мкм толщины срезов.
Уже более 30 лет развивается альтернативный метод - мягкая рентгеновская микроскопия в спектральной области "окна прозрачности воды" (МРМ). Одно из ее достоинств - естественный, более порядка, абсорбционный контраст между водо- и углеродсодержащими объектами, что исключает необходимость контрастирования образцов. Также мягкая рентгеновская спектроскопия обеспечивает нанометровое пространственное разрешение, обладает короткой длиной волны и высокой проникающей способностью, до десятков микрометров. Это позволяет исследовать биологический образец в нативном и, потенциально, даже в живом состоянии. Однако ключевая проблема в том, что изображение сильно размывается вдоль оптической оси в микроскопах на зонных пластинках Френеля. Чтобы получить более четкое изображение, приходится снимать полный угловой стек, из-за чего в живой образец проникают поглощенные дозы и разрушают его. Поэтому мягкая рентгеновская микроскопия до сих пор не заняла подобающего места в арсенале клеточной биологии.
Наш проект направлен на развитие физических принципов этого метода на основе светосильных многослойных зеркал. Значительное внимание будет уделено созданию оптики дифракционного качества, подготовке образцов, в том числе в живом состоянии, экспериментальным методикам, в частности z-томографии. Мы планируем разработать МРМ с пространственным 3D разрешением, превышающим мировой уровень. Верификация данного метода будет проводиться в сравнении с результатами уже зарекомендовавших себя методов - флуоресцентной микроскопии сверх-разрешения и электронной микроскопии. Надеемся, что это позволит мягкой рентгеновской микроскопии занять подобающее ей место в арсенале клеточной биологии.
Наш отдел многослойной ренгеновской оптики и лаборатория перспективного приборостроения занимаются этой темой около 5 лет. За это время мы запустили ЭУФ-микроскоп на длину волны 13.8 нм и получили трёхмерные изображения фиксированных образцов с разрешением до 140 нм. Данный грант РНФ позволит нам продвинуться в область "водного окна", длина волны 3.37 нм, в которой за счёт большого контраста между белком и водой и более короткой длины волны мы сможем увидеть живые клетки с разрешением до 50 нм. Также благодаря короткой глубине фокуса зеркального микроскопа мы сможем понаблюдать за динамикой живых клеток.
Исследование проводится на стыке рентгеновской физики, клеточной биологии и медицины. В этом проекте мы сотрудничаем с коллективом из Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Коллеги отвечают за образцы и их верификацию в электронной микроскопии, а мы - за разработку мягкого рентгеновского микроскопа и измерение на нём предоставленных образцов. Данные, полученные в результате исследования, будут полезны, например, для изучения клеток мозга, раковых тканей, внутриклеточных процессов, внеклеточной архитектуры».