Базовая микроскопия, 2 часть

DS Micro·7 Nov 2020

https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/index.html

Освещение и оптическая схема микроскопа

Конструкция оптического микроскопа должна обеспечивать организацию и точное направление световых лучей через прибор. Освещение образца является наиболее важной контролируемой переменной в достижении высококачественных изображений при микроскопии, критической микрофотографии и цифровой визуализации. Отсутствие яркости не является проблемой в простой светлопольной микроскопии, но если используются методы повышения контрастности, такие как фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст, флуоресценция или поляризационный контраст, дополнительные оптические элементы, потребляющие значительную часть доступного светового потока вставляются в путь луча. Такая ситуация оставляет мало света для наблюдения, и в результате изображения приобретают темный характер. При правильной настройке Свет из конденсора заполняет заднюю фокальную плоскость объектива формирующим изображение светом, проецируя световой конус для освещения поля зрения. Апертурная диафрагма конденсатора отвечает за регулирование угла освещающего светового конуса и, следовательно, числовой апертуры конденсатора. Эта концепция проиллюстрирована на рисунке 1, где серия конденсаторов проиллюстрирована световыми конусами (и числовыми апертурами) уменьшающегося размера слева направо на рисунке.

Еще одна причина существования фиксированных и регулируемых диафрагм, призм, светоделителей и фильтров в микроскопе заключается в том, что освещение часто необходимо сбрасывать после каждой смены объектива. Отчасти это связано с тем, что размер наблюдаемого поля образца изменяется с каждым увеличением объектива. Объектив с небольшим увеличением (например, 4-кратным) обеспечивает большое поле наблюдения (в данном случае диаметром до 5 миллиметров, при условии, что окуляр позволяет наблюдать промежуточное изображение диаметром 20 миллиметров). Если переключиться на объектив 40x, диаметр поля зрения образца уменьшится в 10 раз (всего до 0,5 миллиметра). Тогда видимая область становится в 100 раз меньше. Вторая причина в том, что числовая апертура увеличивается с 0,12 до 0,65 или, выражается как апертурные углы от 15 до 80 градусов. Влияние числовой апертуры на размер и форму светового конуса освещения показано на рисунке 1.

Существует множество источников света для освещения микроскопов, как для обычных наблюдений, так и для количественной цифровой визуализации. Наиболее распространенным источником света из-за его низкой стоимости и длительного срока службы являются вольфрамово-галогенные лампы мощностью от 30 до 100 Вт. Эти лампы относительно яркие, с цветовым спектром с центром в 3200 К (при установке, близкой к номинальному напряжению лампы), но для повышения их цветовой температуры до эквивалента дневного света требуются фильтры преобразования цвета. Еще одним популярным источником света является ксеноновая дуговая лампа мощностью от 75 до 150 Вт из-за ее очень высокой яркости и длительного срока службы. Ксеноновые лампы имеют относительно равномерную мощность во всем видимом спектре и цветовую температуру, приближающуюся к дневному свету. Когда требуется очень высокая сила света, металлогалогенные и ртутные лампы, а также лазеры. В флуоресцентной микроскопии, особенно для получения цифровых изображений, в течение последних нескольких десятилетий использовались ртутные горелки мощностью 100 или 200 Вт. Эти лампы постепенно уступают место более стабильным и долговечным металлогалогенным лампам, которые имеют более высокую интенсивность в областях континуума. Все чаще светодиоды (Светодиоды ) используются в качестве источника для освещения микроскопа в проходящем свете, а также флуоресценции.

Много лет назад угольные дуговые лампы или циркониевые лампы использовались для достижения высокого уровня освещения, но эти старинные источники редко можно увидеть сегодня, потому что лампы снижали качество и однородность света, достигающего образца. Освещение Келера устраняет многие ограничения, присущие источникам света накаливания и дугового разряда, за счет создания параллельных лучей, которые организованно проходят через образец. Стратегия Келера требует, чтобы освещалось только видимое поле образца, так как чрезмерный свет за пределами поля зрения содержит рассеянный свет, который снижает контраст. Но в то же время одним из наиболее важных аспектов микроскопии является то, что световой конус освещения всегда должен соответствовать угловой апертуре объектива, чтобы можно было эффективно использовать всю апертуру оптики. Это единственный способ добиться максимальной разрешающей способности.

Оптическая система и множество других компонентов современного микроскопа представлены в разрезе на рис. 2. Конденсор (содержащий апертурную диафрагму) и диафрагма светового поля, обычно содержащаяся в основании стойки, являются критическими элементами в достижении Келера. освещение. Формирующие изображение световые лучи, прошедшие через образец, улавливаются объективом микроскопа и направляются либо в окуляры, либо в один из нескольких портов камеры. На протяжении всей оптической системы микроскопа свет направляется и фокусируется через серию диафрагм и линз по мере того, как он проходит от источника света для освещения образца и затем попадает в окуляры или насадку для камеры. Закрытие или открытие диафрагмы конденсатора контролирует угол, под которым световые лучи выходят из конденсатора и достигают образца со всех азимутов. Поскольку сам источник света не сфокусирован на уровне образца, освещение на уровне образца по существу беззернистое и расширенное (по сути, создавая однородное поле освещения) и не страдает от повреждений из-за пыли и дефектов на стеклянных поверхностях. конденсатора. Настройка апертурной диафрагмы конденсора, наряду с числовой апертурой объектива, определяет реализованную числовую апертуру всей системы микроскопа. Диафрагма светового поля определяет, какая часть и размер образца освещается. Апертурная диафрагма конденсора отображается на зрачке объектива и регулирует его свечение. Вся оптическая система спроектирована таким образом, что углы раскрытия световых конусов правильно установлены вместе с апертурной диафрагмой.

Сопряженные плоскости в микроскопе

Микроскоп содержит две разные группы чересстрочных оптических плоскостей, которые отвечают за управление освещением и формирование изображения. В совокупности эти оптические плоскости известны как сопряженные плоскости . Первая группа плоскостей (называемых плоскостями апертуры ) управляет траекторией луча для освещения и создает сфокусированное изображение нити накала лампы в плоскости апертурной диафрагмы конденсатора подэтапа, задней фокальной плоскости объектива и точке глаза ( также называемый диском Рамсдена) окуляра. Сопряженные плоскости находятся в общем фокусе и имеют решающее значение для достижения правильного освещения Келера. Второй набор плоскостей, известный как формирующий изображение сопряженные плоскости включают полевую диафрагму, образец, неподвижную диафрагму окуляра и сетчатку глаза или поверхность детектора камеры. По определению, объект, который находится в фокусе в одной плоскости, также находится в фокусе в других сопряженных плоскостях этого светового пути. В каждом световом пути (как формировании изображения, так и освещении) есть четыре отдельных плоскости, которые вместе составляют набор сопряженных плоскостей.

Итак, сопряженные плоскости на пути освещающих световых лучей в освещении Келера (рис. 3 (а)) включают:

Лампа накаливания.

Апертурная диафрагма конденсатора (в передней фокальной плоскости конденсатора).

Задняя фокальная плоскость объектива.

Точка глаза (также называемая диском Рамсдена) окуляра, которая расположена примерно на полдюйма (один сантиметр) над верхней линзой окуляра, в точке, где наблюдатель помещает переднюю часть глаза во время наблюдения.

Точно так же сопряженные плоскости на световом пути формирования изображения при освещении Келера (рис. 3 (b)) включают:

Полевая диафрагма.

Сфокусированный экземпляр.

Плоскость промежуточного изображения (т. Е. Плоскость неподвижной диафрагмы окуляра).

Сетчатка глаза, плоскость пленки или поверхность датчика изображения камеры.

Сопряженные фокальные плоскости часто используются при поиске неисправностей микроскопа на предмет загрязнения пыли, волокон и дефектов оптических элементов. Если эти артефакты находятся в резком фокусе, это означает, что они должны находиться на поверхности или вблизи нее, которая является частью формирующего изображение набора сопряженных плоскостей. В состав этого набора входят стеклянный элемент на оптическом отверстии микроскопа, образец, сетка в окуляре и нижняя линза окуляра. В качестве альтернативы, если эти загрязнения нечеткие и не в фокусе, ищите их рядом с освещающим набором элементов, которые имеют общие сопряженные плоскости. Подозреваемыми в этой категории являются верхняя линза конденсора (где часто скапливаются пыль и грязь), открытая линза окуляра (загрязнения с ресниц) и передняя линза объектива (обычно пятна отпечатков пальцев).

Без преувеличения можно сказать, что почти все искусство и наука микроскопии (если не принимать во внимание подготовку образцов) зависит от правильного использования светового поля и апертурных диафрагм. К счастью, для этого есть простые правила. Последующие обсуждения в этом разделе подробно описывают, как правильно настроить микроскоп для освещения Келера. Этот метод рекомендуется всеми производителями современных лабораторных микроскопов, потому что он может обеспечивать равномерно яркое и безбликовое освещение образца, что позволяет пользователю полностью реализовать потенциал микроскопа. Вам будет намного легче, если вы познакомитесь с отношениями между сопряженными плоскостями. Плоскости апертуры (также известные как зрачки) отвечают за разрешающую способность и методы контрастирования и могут регулироваться светофильтрами и настройками диафрагмы. Напротив, плоскости поля содержат изображения, сформированные оптическими компонентами микроскопа, и являются домом для сеток и шкал, используемых для измерения длины. Плоскости поля управляются через диафрагму поля.

Полевая диафрагма в основании микроскопа регулирует только ширину пучка световых лучей, попадающих в конденсор. Эта переменная диафрагма не влияет на оптическое разрешение, числовую апертуру или интенсивность освещения. Правильная настройка полевой диафрагмы (фактически центрированной на оптическом пути и открытой так, чтобы лежать сразу за пределами поля зрения) важна для предотвращения бликов, которые могут уменьшить контраст наблюдаемого изображения. Устранение лишнего света особенно важно при попытке изображения образцов с изначально низкой контрастностью. Когда диафрагма поля открыта слишком далеко, рассеянный свет, исходящий от образца, и свет, отраженный под косым углом от оптических поверхностей, могут ухудшить качество изображения.

Конденсор подэтапа обычно устанавливается непосредственно под столиком микроскопа в кронштейне, который можно поднимать или опускать независимо от столика путем вращения ручки с рифленой головкой. Апертурная диафрагма открывается и закрывается поворотным плечом, рычагом или поворотом манжеты на корпусе конденсатора. Следует отметить, что правильная регулировка конденсатора подэтапа, вероятно, является наиболее важным аспектом достижения надлежащего освещения Келера. Однако, к сожалению, перекос конденсора и неправильно отрегулированные апертурные диафрагмы конденсора являются основными причинами ухудшения качества изображения и некачественной микрофотографии.

Освещение по Кёлеру

Освещение образца является наиболее важным параметром для получения высококачественных изображений при микроскопии и критической микрофотографии или цифровой визуализации. Впервые освещение по Кёлером было введено в 1893 году Августом Кёлером из корпорации Carl Zeiss как метод обеспечения оптимального освещения образца. Производители сконструировали современные микроскопы таким образом, что коллекторная линза и любые другие оптические компоненты, встроенные в основание микроскопа, будут проецировать увеличенное и сфокусированное изображение нити накала лампы на плоскость апертурной диафрагмы правильно расположенного конденсатора подстадия. Закрытие или открытие диафрагмы конденсатора контролирует угол, под которым световые лучи выходят из конденсатора и достигают образца со всех азимутов. Поскольку источник света не сфокусирован на уровне образца, свет на уровне образца по существу беззернистый и расширенный и не страдает от повреждений из-за пыли и дефектов на стеклянных поверхностях конденсатора. Открытие и закрытие апертурной диафрагмы конденсора контролирует угол падения светового конуса на образец. Настройка апертурной диафрагмы конденсора вместе с апертурой объектива определяет реализована числовая апертура микроскопической системы. При открытии диафрагмы конденсатора рабочая числовая апертура микроскопа увеличивается, что приводит к увеличению разрешающей способности и светопропускания. Параллельные световые лучи, которые проходят через образец и освещают его, фокусируются в задней фокальной плоскости объектива, где изображение диафрагмы переменной апертуры конденсора и изображение источника света будут видны в фокусе.

Правильная конфигурация микроскопа в отношении освещения - это, возможно, одна из наиболее неправильно понимаемых концепций в оптической микроскопии и критический параметр, который необходимо соблюдать для достижения оптимальных характеристик. Интенсивность и спектр длин волн света, излучаемого источником освещения, имеют большое значение, но еще более важно, чтобы свет, излучаемый из различных мест на нити лампы, собирался и фокусировался в плоскости апертурной диафрагмы конденсатора. Плоскости сопряженного поля и апертуры, критические для создания надлежащего освещения в микроскопе, показаны на рисунке 1. В этом разделе описаны инструкции по установке освещения Келера (используется в микроскопии проходящего и отраженного света).

Первые шаги, необходимые для подготовки микроскопа к освещению Келером, включают базовые процедуры, необходимые для наблюдения за образцом в условиях светлого поля. Во-первых, если конденсатор содержит кольца фазового кольца, призмы дифференциального интерференционного контраста или другие маски и фильтры, поверните турель к апертуре светлого поля , которая должна быть открытой, а не вмещать фильтр или призму. Во-вторых, выберите подходящий экземпляр. Лучшие образцы состоят из хорошо окрашенных образцов светлого поля, таких как очень тонкие (8 микрометров или меньше) ткани животных или растений. Если подготовленное предметное стекло недоступно, небольшой участок 35-миллиметровой пленки (такой как прозрачная пленка или негатив) размером около 10 x 10 миллиметров можно приклеить к чистому стеклянному предметному стеклу микроскопа и сплющить покровным стеклом.

Шаги в установлении освещения по Кёлеру

Включите источник света и держите небольшой лист бумаги прямо над линзой коллектора диафрагмы светового поля в основании микроскопа (рис. 2 (а)). Цель этого упражнения - проверить, работает ли источник света и направляет ли свет в микроскоп. В случаях, когда не наблюдается света, а бумага остается темной, проверьте сетевой шнур, осветитель и, возможно, предохранитель в блоке питания, чтобы убедиться, что электрические компоненты не повреждены. Если нет, замените лампу подсветки. Когда микроскоп работает нормально, на бумаге будет видно небольшое пятно света (рис. 2 (а)).
Затем откройте полевую диафрагму до самого широкого положения (полностью открытого), повернув рычаг или ручку. Пятно света, проецируемое на лист бумаги (рис. 2 (б)), достигнет максимального диаметра.

Следующий шаг - переместить лист бумаги и поместить его между образцом и объективом (Рисунок 3 (а)) и полностью открыть апертурную диафрагму конденсора (обычно управляемую рычагом или ручкой с накаткой, расположенной на корпусе конденсатора. Диафрагма конденсатора медленно открывается, интенсивность света, проецируемого на лист бумаги, увеличивается, достигая максимальной яркости при полностью открытом положении.При использовании конденсора с низкой числовой апертурой, оснащенного поворотной передней линзой, снимите поворотную линзу от светового пути, прежде чем пытаться выполнить эту процедуру.
Высоту конденсора можно регулировать с помощью ручки привода, которая перемещает этот компонент вверх и вниз вдоль оптической оси микроскопа (рис. 3 (b)). Установите высоту конденсора так, чтобы передняя линза находилась примерно на 1–3 миллиметра ниже нижней поверхности предметного стекла. Убедитесь, что передняя линза конденсора не касается предметного стекла (или не отталкивает его от предметного столика). В крайних случаях, втягивание конденсатора в образец приведет к выбросу образца из столика, когда он выскользнет из удерживающей направляющей. Современные микроскопы часто оснащены регулируемым стопорным винтом, который позволяет зафиксировать верхнее положение конденсора на заданной высоте.

Теперь свет должен быть различим в окулярах микроскопа (рис. 4 (а)). Если свет слишком яркий (часто достаточно яркий, чтобы вызывать дискомфорт), уменьшайте интенсивность, пока не найдете уровень, с которым удобно работать. Затем установите межзрачковое расстояние с помощью складной перемычки бинокулярных тубусов. Это можно сделать, сжав трубки вместе, чтобы уменьшить расстояние, или раздвинув трубки, чтобы увеличить расстояние между ними. Правильное расстояние достигается, когда один большой световой круг (вместо двух) можно легко визуализировать через окуляры. Следующий шаг - проверить, оснащен ли микроскоп фокусирующими окулярами. Если да, поверните подвижный окуляр в нулевое положение. Лица, носящие очки, могут не снимать очки.
Вглядитесь в микроскоп и осторожно перемещайте столик, включая образец, вверх и вниз, пока не увидите детали изображения как можно четче (Рисунок 4 (b)). На этом этапе могут быть яркие и темные пятна или часть диафрагмы, закрывающая поле зрения, поскольку конфигурация освещения еще не завершена.

Теперь, когда основные компоненты микроскопа установлены, прибор готов к настройке для освещения по Кёлеру. Первый шаг - сузить размер полевой диафрагмы и перемещать конденсор вверх и вниз с помощью регулировочной ручки, пока вы не увидите четкое изображение краев лепестков полевой диафрагмы (Рисунок 5 (a)). Если эта стратегия не работает, измените размер полевой диафрагмы и попробуйте еще раз. Во многих случаях конденсор еще не отцентрован, поэтому только один край поля обзора будет содержать элементы лепестков полевой диафрагмы.
На этом этапе диафрагма поля находится в резком фокусе, но конденсор еще не отцентрирован. Центрирующие ручки на монтажной раме конденсора микроскопа используются для центрирования конденсора (Рисунок 5 (b)). Закройте диафрагму поля до ее наименьшего отверстия и с помощью центрирующих винтов переместите яркое отверстие в центр поля обзора (сетка перекрестия очень полезна для определения центра поля обзора). После центрирования конденсора открывайте полевую диафрагму до тех пор, пока ее створки полностью не выйдут из поля зрения.

На этом этапе процедуры у вас должно быть почти подходящее изображение в поле обзора. Единственная оставшаяся задача - оптимизировать контраст. Помните, что вы сначала открыли апертурную диафрагму конденсатора, чтобы видеть больше света (обсуждалось выше). Теперь необходимо скорректировать размер диафрагмы, чтобы улучшить контраст и найти подходящий баланс между контрастом и разрешением. Помните, что слишком сильное закрытие апертуры конденсора серьезно ухудшит разрешение и значительно затемнит изображение.
Вы можете непосредственно визуализировать апертурную диафрагму, наложенную на заднюю фокальную плоскость объектива ( зрачок объектива).), если вы снимите окуляр с крепления тубуса бинокля и посмотрите прямо в тубус (Рисунок 6 (a)). Ваш глаз должен находиться на расстоянии от 10 до 20 сантиметров от трубки для наилучшего наблюдения. Глядя в трубку, открывайте и закрывайте апертурную диафрагму конденсора до тех пор, пока вы не сможете четко распознать изображение в зрачке объектива. Наконец, установите диаметр диафрагмы таким образом, чтобы она освещала от 65 до 80 процентов диаметра зрачка (см. Рисунок 6 (b)), обеспечивая почти полное разрешение и оптимальный контраст. Такой компромисс обычно делается при выборе разрешения, поскольку именно контраст делает изображение приемлемым для глаза. После регулировки апертурной диафрагмы конденсора вставьте окуляр обратно в крепление тубуса бинокля.

Теперь микроскоп должен быть правильно настроен для наблюдения за образцами при освещении по Кёлера, но только для того объектива, который использовался для настройки прибора. Когда другой объектив поворачивается в оптическую цепь, вы всегда должны настраивать апертуру конденсора и полевую диафрагму для оптимального освещения (фактически, контраста в зависимости от разрешения). Однако обычно нет необходимости снимать окуляр каждый раз, когда используется новый объектив. После того, как размер апертурной диафрагмы установлен для объектива 10x, часто бывает достаточно адаптировать размер для других объективов путем визуализации изображения. Сначала откройте диафрагму до упора, а затем медленно закройте ее, пока изображение не станет немного темнее и одновременно не увеличится контраст. Часто, из приведенного выше обсуждения очевидно, что апертурная диафрагма конденсатора должна быть установлена в положение, обеспечивающее компромиссное сочетание прямого и отклоненного света, которое в значительной степени зависит от характеристик поглощения, дифракции и преломления образца. Это должно быть выполнено без искажения изображения артефактами, которые затемняют детали и представляют собой ошибочное усиление контраста. Количество деталей и контрастность изображения, необходимое для получения наилучшей микрофотографии, также зависит от показателя преломления, оптических характеристик и других параметров, зависящих от образца.

Когда апертурная диафрагма закрыта по ошибке слишком далеко, отклоненный свет начинает заслонять прямые освещающие лучи, что приводит к дифракционным артефактам, которые вызывают видимые полосы, полосы и / или формирование рисунка на микрофотографиях. Другие проблемы, такие как явление преломления, также могут создавать видимые структуры на изображении, которые не являются реальными. В качестве альтернативы, слишком широкое открытие апертуры конденсора вызывает нежелательные блики и рассеяние света от образца и оптических поверхностей внутри микроскопа. Это приводит к значительной потере контраста и размыванию деталей изображения. Правильная настройка будет варьироваться от образца к образцу. и опытный микроскопист скоро научится точно регулировать апертурную диафрагму конденсора (и числовую апертуру системы), наблюдая изображение, не глядя на диафрагму в задней фокальной плоскости объектива. Фактически, многие микроскописты считают, что критическое уменьшение числовой апертуры системы микроскопа для оптимизации качества изображения является самым важным шагом в микрофотографии.

Система освещения микроскопа, настроенная на правильное освещение по Кёлеру, должна удовлетворять нескольким требованиям. Освещенная область плоскости образца должна быть не меньше поля зрения любого заданного объектива. Кроме того, свет должен иметь одинаковую интенсивность, а числовая апертура должна варьироваться от максимального (равного значению объектива) до минимального значения, которое будет зависеть от оптических характеристик образца.

Оптика микроскопа

Один из наиболее важных критериев, который следует учитывать при покупке оптического микроскопа, - это область применения. Другим, возможно, не менее важным, является состояние коррекции (аберрации) оптических компонентов, в частности, объективов. Объективы микроскопа, возможно, являются наиболее важными компонентами оптического микроскопа, поскольку они отвечают за формирование первичного изображения и играют центральную роль в определении качества изображений, которые микроскоп может создавать. Объективы также играют важную роль в определении увеличения конкретного образца и разрешения, при котором мелкие детали образца можно наблюдать и регистрировать с помощью микроскопа. Объектив - это наиболее сложный для проектирования и изготовления компонент оптического микроскопа.

Оптические компоненты, входящие в состав современных микроскопов, смонтированы на стабильной, эргономичной основе, которая обеспечивает быструю замену, точное центрирование и тщательную юстировку между оптически взаимозависимыми узлами. Вместе оптические и механические компоненты микроскопа, включая установленный на стеклянном микроскопе образец и покровное стекло, образуют оптическую цепь с центральной осью, которая пересекает основание микроскопа и подставку. Оптическая система микроскопа обычно состоит из осветителя (включая источник света и коллекторную линзу), конденсатора подэтапа, который служит для подготовки освещения для формирования изображения, образца, объектива, окуляра и детектора, который представляет собой камеру или глаз наблюдателя. .

Микроскопы исследовательского уровня также содержат одно из нескольких устройств кондиционирования света, которые часто располагаются между осветителем и конденсором, и дополнительный детектор или фильтрующее устройство, которое вставляется между объективом и окуляром или камерой. Устройство (а) кондиционирования и детектор работают вместе, чтобы изменять контраст изображения в зависимости от пространственной частоты, фазы, поляризации, поглощения, флуоресценции, внеосевого освещения и / или других свойств образца и техники освещения. Даже без добавления специальных устройств для кондиционирования освещения и фильтрации формирующих изображение волн, некоторая степень естественной фильтрации происходит даже с самой базовой конфигурацией микроскопа.

В то время как некоторые из оптических компонентов микроскопа действуют как элементы формирования изображения, другие служат для создания различных модификаций освещения образца, а также выполняют функции фильтрации или преобразования. Компоненты, участвующие в формировании изображений с помощью оптической системы микроскопа, - это линза коллектора (расположенная внутри или рядом с осветителем), конденсор, объектив, окуляр (или окуляр) и преломляющие элементы человеческого глаза или линзы камеры. Хотя некоторые из этих компонентов обычно не считаются компонентами изображения, их свойства изображения имеют первостепенное значение при определении окончательного качества изображения микроскопа.

Конденсоры

В вертикальных микроскопах конденсор расположен под столиком и служит для сбора волновых фронтов от источника света микроскопа и их концентрации в световом конусе, который освещает образец с равномерной интенсивностью по всему полю обзора. Инвертированные микроскопы (стиль культуры ткани) устанавливают конденсор над предметным столиком, а образец - на опору рамы. Очень важно, чтобы световой конус конденсатора был правильно отрегулирован для оптимизации интенсивности и угла света, попадающего в переднюю линзу объектива. Каждый раз при смене объектива необходимо выполнять соответствующую настройку конденсора, чтобы обеспечить правильный световой конус, соответствующий световому конусу (числовой апертуре) нового объектива. Простой двухлинзовый конденсор Аббе показан на рисунке 2. На этом рисунке апертурная диафрагма , расположенная в основании конденсора, концентрируется внутренними линзовыми элементами, которые затем проецируют свет через образец параллельными пучками с любого азимута. Размер и числовая апертура светового конуса определяется регулировкой апертурной диафрагмы. Пройдя через образец, свет рассеивается в перевернутый конус с правильным углом, чтобы заполнить переднюю линзу объектива.

Регулировка диафрагмы и правильная фокусировка конденсора (с учетом высоты по отношению к объективу) имеют решающее значение для реализации полного потенциала объектива. В частности, правильное использование ирисовой диафрагмы с регулируемой апертурой (встроенной в конденсатор или чуть ниже него) имеет большое значение для обеспечения правильного освещения, контраста и глубины резкости. Размер отверстия этой ирисовой диафрагмы регулирует углы освещающих волновых фронтов (и, следовательно, размер апертуры), которые омывают образец. Высота конденсора контролируется системой реечной передачи, которая позволяет регулировать фокус конденсора для надлежащего освещения образца.

Конденсаторы делятся в первую очередь на классификации модальности изображения (такие как светлое поле, темное поле и фазовый контраст), но также и по степени их оптической коррекции. Существует четыре основных типа конденсаторов в отношении коррекции оптических аберраций, перечисленных в таблице 1. Самый простой и наименее исправляемый (а также наименее дорогой) конденсатор - это конденсатор Аббе.конденсатор, который может иметь числовую апертуру до 1,4 в лучших моделях с тремя и более внутренними линзами. Хотя конденсор Аббе способен пропускать яркий свет, он не корректируется ни на хроматические, ни на сферические оптические аберрации. Типичный конденсатор Аббе показан на рисунке 2. В простейшей форме конденсор Аббе имеет две оптические линзы, которые создают изображение светящейся полевой диафрагмы, которое не является резким и окружено синим и красным цветом по краям, характерным для Хроматическая аберрация.

Следующий уровень сложности конденсатора разделен между апланатическим и ахроматическим конденсаторами, которые корректируются исключительно для сферических (апланатических) или хроматических (ахроматических) оптических аберраций. Ахроматические конденсаторы обычно содержат от трех до четырех линз и корректируют хроматические аберрации по двум длинам волн (красный и синий). Ахроматический конденсор обычно содержит четыре линзовых элемента и имеет числовую апертуру от 0,9 до 1,4. Такая конструкция конденсатора полезна как для рутинных, так и для критических лабораторных анализов с «сухими» или масляными иммерсионными объективами, а также для черно-белой или цветной микрофотографии и цифровых изображений. Самый высокий уровень коррекции оптической аберрации включен в апланатически-ахроматический конденсор. Этот конденсор хорошо корректируется как для хроматических, так и для сферических аберраций и является предпочтительным конденсатором для использования в критических цветных изображениях с белым светом. Типичный апланатико-ахроматический конденсатор имеет восемь внутренних линзовых элементов, скрепленных в два дублета и четыре одиночные линзы.

таблица 1

Коррекция аберраций в конденсаторных оптических системах

Тип конденсатора: Аббат,Апланатический,Ахроматический,Апланатически-ахроматический

Сферическая : -,+,-,+
аберрация

Хроматическая: -,-,+,+
аберрация

Гравировка на корпусе конденсатора включает его тип (ахроматический, апланатический и т. Д.), Числовую апертуру и градуированную шкалу, которая указывает приблизительную настройку (размер) апертурной диафрагмы. Конденсаторы с числовой апертурой выше 0,95 работают лучше всего, когда на их верхнюю линзу наносится капля масла, которая контактирует с нижней поверхностью предметного стекла. Это гарантирует, что косые лучи света, исходящие из конденсатора, не отражаются снизу предметного стекла, а направляются внутрь образца. На практике это может стать утомительным и нечасто делается в обычной микроскопии, но очень важно при работе с высоким разрешением и для получения точных изображений с использованием мощных (и с числовой апертурой) объективов.

При изменении объектива, например с 10x на 20x, апертурная диафрагма конденсора также должна быть отрегулирована, чтобы обеспечить новый световой конус, соответствующий числовой апертуре нового объектива. Это делается поворотом ручки с накаткой или рычага, который управляет апертурной диафрагмой конденсатора. На конденсоре есть небольшая желтая или белая точка, стрелка или метка, которая указывает относительный размер апертуры по сравнению с линейной градацией на корпусе конденсора. Многие производители синхронизируют эту градацию, чтобы она соответствовала приблизительной числовой апертуре конденсатора. Например, если микроскопист выбрал объектив 10x с числовой апертурой 0,25, то стрелка будет помещена рядом со значением 0,18-0.

Окуляры

Окуляры работают в сочетании с объективами микроскопа, чтобы еще больше увеличить промежуточное изображение, чтобы можно было рассмотреть детали образца. Окуляры альтернативное название окуляров, которое широко используется в литературе. Для получения наилучших результатов в микроскопии необходимо, чтобы объективы использовались в сочетании с окулярами, которые соответствуют коррекции и типу объектива. Базовая анатомия типичного современного окуляра показана на рисунке 3. Надписи на боковой стороне окуляра описывают его конкретные характеристики и функции. Существует два основных типа окуляров, сгруппированных в соответствии с расположением линз и диафрагмы: отрицательные окуляры с внутренней диафрагмой и положительные окуляры, у которых диафрагма находится под линзами окуляра. Отрицательные окуляры имеют две линзы: верхняя линза, которая находится ближе всего к глазу наблюдателя, называется линзой глаза, а нижняя линза (под диафрагмой) часто называется полевой линзой. В простейшей форме обе линзы плоско-выпуклые, выпуклыми сторонами обращены к образцу. Примерно посередине между этими линзами находится фиксированное круглое отверстие или внутренняя диафрагма, которая своим размером определяет круговое поле зрения, наблюдаемое при взгляде в микроскоп.

Простейшая конструкция отрицательного окуляра, часто называемая окуляром Гюйгена , встречается в большинстве учебных и лабораторных микроскопов, оснащенных ахроматическими объективами. Хотя Гюйгеновский глаз и полевые линзы плохо корректируются, их аберрации, как правило, нейтрализуют друг друга. В более высококорректированных негативных окулярах две или три линзы скреплены и объединены в линзу глаза. Если неизвестный окуляр имеет только увеличение, указанное на корпусе, это, скорее всего, окуляр Гюйгена, который лучше всего подходит для использования с ахроматическими объективами с увеличением от 5 до 40 крат. Другой распространенный окуляр - положительный окуляр с диафрагмой под линзами, широко известный как окуляр Рамсдена.окуляр. Этот окуляр имеет линзу глаза и линзу поля, которые также плоско-выпуклые, но линза поля устанавливается так, чтобы изогнутая поверхность была обращена к линзе глаза. Передняя фокальная плоскость этого окуляра расположена чуть ниже полевой линзы, на уровне диафрагмы окуляра, что позволяет легко адаптировать этот окуляр для установки прицелов.Простые окуляры, такие как Huygenian и Ramsden, и их ахроматизированные аналоги не корректируют остаточную хроматическую разницу увеличения на промежуточном изображении, особенно при использовании в сочетании с ахроматическими объективами с большим увеличением, а также с любыми флюоритовыми или апохроматическими объективами. Чтобы исправить это, производители выпускают компенсирующие окуляры, которые вносят равную, но противоположную хроматическую ошибку в элементы объектива. Компенсирующие окуляры могут быть как положительного, так и отрицательного типа и должны использоваться при всех увеличениях с флюоритовыми, апохроматическими и всеми вариациями плановых объективов (их также можно использовать с ахроматическими объективами 40x и выше). За последние годы,

Компенсирующие окуляры играют решающую роль в устранении остаточных хроматических аберраций, присущих конструкции объективов с высокой коррекцией на старых микроскопах с конечной длиной трубки. Следовательно, предпочтительно, чтобы микроскопист использовал компенсирующие окуляры, разработанные конкретным производителем для сопровождения объективов этого производителя с более высокой коррекцией. Использование неподходящего окуляра с апохроматическим объективом, предназначенного для использования с более старой трубкой с конечной (160 или 170 миллиметров) длиной, приводит к резкому увеличению контраста с красными полосами на внешних диаметрах и синими полосами на внутренних диаметрах детали образца. Дополнительные проблемы возникают из-за ограниченной ровности поля зрения в простых окулярах, даже если они корректируются с помощью дублетов линз. Более совершенная конструкция окуляров позволилаКонструкция окуляра периплана (см. Рисунок 3). Этот окуляр состоит из семи линз, скрепленных в один дуплет, один триплет и две отдельные линзы. Усовершенствования конструкции периплоскостных окуляров приводят к лучшей коррекции остаточной латеральной хроматической аберрации, повышенной ровности поля и в целом к улучшению характеристик при использовании с более мощными объективами.

Современные микроскопы оснащены значительно улучшенными объективами с коррекцией плана, в которых основное изображение имеет гораздо меньшую кривизну поля, чем старые объективы. Кроме того, большинство микроскопов теперь имеют гораздо более широкие тубусы, что значительно увеличило размер промежуточных изображений. Для решения этих новых функций производители теперь выпускают окуляры с широким полем зрения, которые увеличивают видимую область образца на 40%. Поскольку методы коррекции окуляр-объектив различаются от производителя к производителю, очень важно использовать только окуляры, рекомендованные конкретным производителем для использования с их целями. Кроме того, у большинства окуляров исследовательских микроскопов есть кольцо фокусировки, что позволяет точно сфокусироваться на сетках, которые устанавливаются в пространстве, где находится промежуточное изображение. Кольцо фокусировки также позволяет установить состояние микроскопа, которое называется парфокальный , где операторы с разным зрением могут настроить микроскоп таким образом, чтобы изображения, создаваемые объективом, оставались в фокусе, когда новый объектив вставляется в оптический путь.

Объективы

Наиболее важным компонентом формирования изображения в оптическом микроскопе является объектив, сложный многолинзовый узел, который фокусирует световые волны, исходящие от образца, и формирует промежуточное изображение, которое впоследствии увеличивается с помощью окуляров. Объективы отвечают за формирование первичного изображения и играют центральную роль в установлении качества изображений, которые способен выдавать микроскоп. Кроме того, увеличение конкретного образца и разрешение, при котором мелкие детали образца также сильно зависят от объективов микроскопа. Объектив - самый сложный для проектирования и сборки компонент оптического микроскопа. Это первый элемент, с которым сталкивается свет, когда он проходит от образца к плоскости изображения. Объекты получили название из-за того, что они по близости ближайший компонент к объекту,

Основные производители микроскопов предлагают широкий спектр объективов с превосходными оптическими характеристиками в широком спектре условий освещения и обеспечивающих различную степень коррекции первичных оптических аберраций. Объектив, показанный на Рисунке 1, представляет собой мульти-иммерсионный план-апохромат с 20-кратным увеличением, который содержит 9 оптических элементов, скрепленных вместе в две группы дублетов линз, группу тройных подвижных линз и две отдельные внутренние одноэлементные линзы. Объектив также имеет полусферическую переднюю линзу и мениск-вторую линзу, которые работают синхронно, помогая улавливать световые лучи при высокой числовой апертуре с минимальной сферической аберрацией. Многие объективы с большим увеличением оснащены подпружиненным выдвигающимся носовым наконечником, который защищает передние линзы и образец от повреждений при столкновении. Внутренние элементы линз тщательно ориентированы и плотно упакованы в трубчатый латунный корпус, который заключен в декоративную оправу объектива. Конкретные параметры объектива, такие как числовая апертура, увеличение, длина оптической трубки, степень коррекции аберрации и другие важные характеристики отпечатаны или выгравированы на внешней части ствола. Объектив, показанный на рисунке 1, предназначен для работы с использованием воды, глицерина или специального масла на углеводородной основе в качестве среды визуализации. Внутренние элементы линз тщательно ориентированы и плотно упакованы в трубчатый латунный корпус, который заключен в декоративную оправу объектива. Конкретные параметры объектива, такие как числовая апертура, увеличение, длина оптической трубки, степень коррекции аберрации и другие важные характеристики отпечатаны или выгравированы на внешней части ствола. Объектив, показанный на рисунке 1, предназначен для работы с использованием воды, глицерина или специального масла на углеводородной основе в качестве среды визуализации. Внутренние элементы линз тщательно ориентированы и плотно упакованы в трубчатый латунный корпус, который заключен в декоративную оправу объектива. Конкретные параметры объектива, такие как числовая апертура, увеличение, длина оптической трубки, степень коррекции аберрации и другие важные характеристики отпечатаны или выгравированы на внешней части ствола. Объектив, показанный на рисунке 1, предназначен для работы с использованием воды, глицерина или специального масла на углеводородной основе в качестве среды визуализации.

За последние 100 лет строительные технологии и материалы, используемые для изготовления объективов, значительно улучшились. Состоящие из множества внутренних стеклянных линз, современные объективы достигли высокого уровня качества и производительности, учитывая степень коррекции аберраций и плоскостность поля. Объективы в настоящее время разрабатываются с помощью Computer-Aided-Design ( CAD) системы, в которых используются усовершенствованные рецептуры стекла с редкими элементами однородного состава и качества, характеризующиеся высокоспецифическими показателями преломления. Эти передовые методы позволили производителям изготавливать объективы с очень низкой дисперсией и корректировкой большинства распространенных оптических артефактов, таких как кома, астигматизм, геометрические искажения, кривизна поля, сферическая и хроматическая аберрация. Мало того, что объективы микроскопов теперь исправлены для большего количества аберраций в более широких полях, но и блики изображения были значительно уменьшены благодаря современным технологиям покрытия, со значительным увеличением светопропускания, что дает изображения, которые становятся удивительно яркими, резкими и четкими.

Разрешение определяется целью

Существует три важных конструктивных характеристики объектива, которые определяют предел разрешающей способности микроскопа: длина волны света, используемого для освещения образца, угловая апертура светового конуса, захваченного объективом, и показатель преломления в пространстве между объектами. переднюю линзу объектива и образец. Разрешение оптического микроскопа с дифракционным ограничением можно описать как минимальное видимое расстояние между двумя близко расположенными точками образца:

Разрешение = λ / 2n (sin (θ)) (1)

где Разрешение - это минимальное расстояние между двумя точечными объектами, которые четко разрешены, λ - длина волны освещения, n - показатель преломления среды изображения, а θ равна половине угловой апертуры объектива. Учитывая это, очевидно, что разрешение прямо пропорционально длине волны освещения. Человеческий глаз реагирует на диапазон длин волн от 400 до 700 нанометров, который представляет спектр видимого света, который используется для большинства наблюдений под микроскопом. Разрешение также зависит от показателя преломления среды формирования изображения и угловой апертуры объектива. Объективы предназначены для изображения образцов либо через воздух, либо через среду с более высоким показателем преломления между передней линзой и образцом. Поле зрения часто сильно ограничено, и передняя линза объектива расположена близко к образцу, с которым она должна находиться в оптическом контакте. Увеличение разрешения примерно в 1 раз.

Наконец, последний, но, возможно, самый важный фактор в определении разрешения объектива - это угловая апертура, которая имеет практический верхний предел около 72 градусов (при значении синуса 0,95). В сочетании с показателем преломления продукт:

п (грех (θ)) (2)

называется числовой апертурой ( NA), и обеспечивает важный индикатор разрешения для любой конкретной цели. Помимо увеличения, числовая апертура обычно является наиболее важным критерием при выборе объектива микроскопа. Значения варьируются от 0,025 для объективов с очень низким увеличением (от 1x до 4x) до 1,6 для высокопроизводительных объективов, в которых используются специальные иммерсионные масла. По мере увеличения числовой апертуры для серии объективов с одинаковым увеличением происходит большая светосила и разрешение. В наилучших условиях только что разрешенные детали должны быть увеличены в достаточной степени, чтобы их можно было удобно рассматривать, но не до такой степени, что пустое увеличение мешает наблюдению мелких деталей образца. Микроскоп должен тщательно выбирать числовую апертуру объектива в соответствии с увеличением, полученным на окончательном изображении. Увеличение выше этого значения не даст дополнительной полезной информации (или более высокого разрешения деталей изображения) и приведет к ухудшению качества изображения. Превышение предела полезного увеличения приводит к ухудшению изображения.пустое увеличение , где увеличение увеличения просто приведет к увеличению изображения без соответствующего увеличения разрешения.

Подобно тому, как яркость освещения в микроскопе направляется квадратом рабочей числовой апертуры конденсора, яркость изображения, создаваемого объективом, определяется квадратом его числовой апертуры. Кроме того, увеличение объектива также играет роль в определении яркости изображения, которая обратно пропорциональна квадрату бокового увеличения. Квадрат числовой апертуры / отношения увеличения выражает светосилу объектива при использовании с проходящим освещением. Объективы с высокой числовой апертурой собирают больше света и создают более яркое, более скорректированное изображение с высоким разрешением, поскольку они также часто лучше корректируются для аберрации.

Когда объектив собран, сферическая аберрация корректируется путем выбора наилучшего набора прокладок, которые подходят между полусферической и менисковой линзами (нижние крепления объектива). Объектив парфокализуется за счет перемещения всей группы линз вверх или вниз внутри гильзы с помощью стопорных гаек, так что фокус не будет потерян при замене объективов, размещенных на множестве револьверных головок. Регулировка комы осуществляется тремя центрирующими винтами, которые оптимизируют положение групп внутренних линз по отношению к оптической оси объектива.

Факторы объективной коррекции

Чаще всего в лабораторных микроскопах используются ахроматические объективы. Такие объективы корректируются на осевые хроматические аберрации в синей и красной длинах волн, которые составляют около 486 и 656 нанометров соответственно. Оба сведены в одну общую точку. Ахроматические объективы также исправлены на сферическую аберрацию зеленого цвета (546 нанометров; см. Таблицу 1). Ограниченная коррекция ахроматических объективов может привести к изображениям с пурпурным ореолом, если фокус выбран в зеленой области спектра. Отсутствие поправки на плоскостность поля (или кривизну поля) представляет собой дополнительную проблему. Планахроматы обеспечивают коррекцию плоского поля для ахроматных объективов (рисунок 2).

Объективы из флюорита изготавливаются из передовых составов стекла, содержащих такие материалы, как плавиковый шпат или новые синтетические заменители, которые позволяют значительно улучшить коррекцию оптической аберрации. Подобно ахроматам, флюоритовые объективы также корректируются хроматически на красный и синий свет, однако флюориты также корректируются сферически на два или три цвета вместо одного цвета, как и ахроматы. По сравнению с ахроматами, флюоритовые объективы имеют более высокую числовую апертуру, что позволяет получать более яркие изображения. Флюоритовые объективы также имеют лучшую разрешающую способность, чем ахроматы, и обеспечивают более высокую степень контраста, что делает их более подходящими для цветной микрофотографии в белом свете.

Объектив третьего типа, апохроматический, имеет самый высокий уровень коррекции (рис. 2). Апохроматические объективы с меньшим увеличением (5x, 10x и 20x) имеют большее рабочее расстояние, чем апохроматные объективы с более высоким увеличением (40x и 100x). Апохроматы почти устраняют хроматическую аберрацию, обычно хроматически корректируются по трем цветам (красный, зеленый и синий) и корректируются сферически по двум или трем длинам волн (см. Таблицу 1). Апохроматические объективы - лучший выбор для цветной микрофотографии в белом свете. Из-за высокого уровня коррекции апохроматные объективы обычно имеют при заданном увеличении более высокие числовые апертуры, чем ахроматы или флюориты. Многие из новых высокоэффективных флюоритовых и апохроматных объективов имеют поправку на четыре (темно-синий, синий, зеленый,

Объективная коррекция оптической аберрации микроскопа

Объективная коррекция оптической аберрации микроскопа

Объективная спецификация

Сферическая аберрация

Хроматическая аберрация

Кривизна поля

Ахромат 1 цвет 2 цвета Нет

План Ахромат 1 цвет 2 цвета да

Флюорит 2-3 цвета 2-3 цвета Нет

План Флюорит 3-4 цвета 2-4 цвета да

План Апохромат 3-4 цвета 4-5 цветов да

1 таблица

Все три типа объективов страдают ярко выраженной кривизной поля, поэтому они проецируют изогнутые изображения, а не плоские. Такой артефакт усиливается при увеличении. Чтобы преодолеть это неотъемлемое условие, разработчики оптики создали объективы с коррекцией плоского поля, которые позволяют получать изображения с общим фокусом во всем поле обзора. Объективы с коррекцией плоского поля и низким уровнем искажений называются планахроматами, планфлюоритами или планапохроматами, в зависимости от степени остаточной аберрации. Эта коррекция, хотя и дорогая, чрезвычайно важна для цифровой визуализации и обычной микрофотографии.

В течение многих лет искривление поля не исправлялось как наиболее серьезная оптическая аберрация, возникающая во флюоритовых (полуапохроматических) и апохроматных объективах, которую допускали как неизбежный артефакт. Внедрение коррекции плоского поля (плана) в объективы улучшило их использование для микрофотографии и видеомикроскопии, и сегодня эти коррекции являются стандартными как для обычных, так и для высокопроизводительных объективов. На рисунке 3 показано, как коррекция кривизны поля (для простого ахромата) добавляет к объективу значительное количество линзовых элементов. Значительное увеличение количества линз для коррекции плана также происходит с флюоритовыми и апохроматными объективами, что часто приводит к чрезвычайно плотной посадке линз (см. Рисунок 1) во внутренней втулке объектива.

Старые объективы обычно имеют меньшую числовую апертуру и подвержены хроматической разнице увеличения, аберрации, которая требует коррекции с помощью специально разработанных компенсирующих окуляров или окуляров. Этот тип коррекции был распространен во время популярности микроскопов с фиксированной длиной трубки, но в современных объективах и микроскопах с коррекцией на бесконечность нет необходимости. В последнее время коррекция хроматической разницы в увеличении либо встроена в сами объективы современных микроскопов (Olympus и Nikon), либо корректируется в линзе тубуса (Leica и Zeiss). Промежуточное изображение в системе с коррекцией на бесконечность появляется за линзой трубки на оптическом пути на эталонном фокусном расстоянии. Фокусное расстояние линзы трубки варьируется от 160 до 250 миллиметров, в зависимости от конструктивных ограничений, установленных производителем. Разделив эталонное фокусное расстояние на фокусное расстояние линзы объектива, можно рассчитать увеличение объектива с коррекцией на бесконечность.

Технические характеристики покровного стекла

Во многих биологических и петрографических приложениях при установке образца стеклянное покровное стекло используется как для защиты целостности образца, так и для обеспечения прозрачного окна для наблюдения. Покровное стекло сближает световые конусы, исходящие из каждой точки образца. Но он также вносит хроматические и сферические аберрации, которые необходимо скорректировать объективом. Показатель преломления, дисперсия и толщина покровного стекла определяют степень схождения световых лучей. Дополнительную озабоченность вызывает водный растворитель или избыток монтажной среды, который находится между образцом и покровным стеклом во влажных или толстых препаратах, которые вносят свой вклад в вариации показателя преломления и толщины покровного стекла.

Среда формирования изображения между передней линзой объектива и покровным стеклом образца является еще одним важным элементом в отношении коррекции сферической аберрации и комы при проектировании линзовых элементов для объективов. Объективы с меньшим увеличением предназначены для использования только с воздухом в качестве среды формирования изображения между передней линзой объектива и покровным стеклом. Максимальная теоретическая числовая апертура, достижимая для воздуха, составляет 1,0, однако на практике практически невозможно создать сухой объектив с числовой апертурой выше 0,95. Влияние изменения толщины покровного стекла незначительно для сухих объективов с числовой апертурой менее 0,4, но такое отклонение становится значительным при числовой апертуре, превышающей 0,65, где колебания величиной всего 0,01 мм могут привести к сферической аберрации.

Возможна корректировка вариаций толщины покровного стекла. Несколько высокоэффективных апохроматных сухих объективов оснащены корректирующими манжетами, которые позволяют регулировать вращающееся кольцо, в результате чего две группы линзовых элементов объектива перемещаются ближе друг к другу или дальше друг от друга (см. Рисунок 4). Различные специализированные фазоконтрастные объективы, разработанные для наблюдения культур тканей с помощью инвертированного микроскопа, имеют еще более широкий диапазон компенсации - от 0 до 2 миллиметров. Таким образом, образцы можно просматривать через дно большинства сосудов для культивирования, которые в этом диапазоне размеров часто имеют резкие колебания толщины.

Число 1½покровное стекло стандартное, толщиной 0,17 миллиметра. К сожалению, не все 1½ покровные стекла изготавливаются в соответствии с этим стандартом (они варьируются от 0,16 до 0,19 миллиметра), и у многих образцов есть среда между ними и покровным стеклом. Регулируя длину механической трубки микроскопа или используя специальные корректирующие кольца, можно обеспечить компенсацию толщины покровного стекла. Числовую апертуру объектива можно радикально увеличить, если использовать объектив с иммерсионной средой, такой как масло, глицерин или вода. Типичные иммерсионные масла имеют показатель преломления 1,51 и профиль дисперсии, аналогичный профилю покровного стекла. Иммерсионная среда с показателем преломления, аналогичным показателю преломления покровного стекла, практически исключает ухудшение изображения из-за изменений толщины покровного стекла, в результате чего лучи с большим углом наклона больше не преломляются и легче захватываются объективом. Лучи света, проходящие через образец, сталкиваются с однородной средой между покровным стеклом и иммерсионным маслом и преломляются не при входе в линзу, а только при выходе из ее верхней поверхности. Следовательно, если образец помещается в апланатической точке первой линзы объектива, изображение этой части системы линз полностью избавляется от сферической аберрации. Лучи света, проходящие через образец, сталкиваются с однородной средой между покровным стеклом и иммерсионным маслом и преломляются не при входе в линзу, а только при выходе из ее верхней поверхности. Следовательно, если образец помещается в апланатической точке первой линзы объектива, изображение этой части системы линз полностью избавляется от сферической аберрации. Лучи света, проходящие через образец, сталкиваются с однородной средой между покровным стеклом и иммерсионным маслом и преломляются не при входе в линзу, а только при выходе из ее верхней поверхности. Следовательно, если образец помещается в апланатической точке первой линзы объектива, изображение этой части системы линз полностью избавляется от сферической аберрации.

Обычная конструкция практичного масляного иммерсионного объектива включает в себя полусферическую переднюю линзу, за которой следуют линза с положительным мениском и группа двойных линз. Апланатические рефракции возникают на первых двух элементах линзы в типичном апохроматическом масляном иммерсионном объективе. Линзы объектива с масляной иммерсией также могут корректировать хроматические дефекты, вносимые первыми двумя элементами линзы, при этом вызывая минимальную сферическую аберрацию. Использование масляного иммерсионного объектива без масла между покровным стеклом и первой линзой приведет к дефектным изображениям из-за рефракции, которые не могут быть исправлены последующими компонентами линзы внутри объектива.

Производители микроскопов производят объективы с ограниченными допусками по показателю преломления и дисперсии. Это означает, что они требуют согласования значений в жидкости, помещенной между покровным стеклом и передней линзой объектива. Рекомендуется использовать только масло, предназначенное объективным производителем, и не смешивать иммерсионные масла между производителями. Кроме того, объективы, использующие воду и / или глицерин в качестве среды визуализации, также доступны для приложений с живыми клетками в культуре или срезами ткани, погруженными в физиологический раствор.

Объективные характеристики

Если вы посмотрите на ствол цели, вы обнаружите, что на нем написано большое количество деталей. На каждой цели нанесено увеличение; длина трубки, на которую был рассчитан объектив, чтобы давать наилучшие изображения; и толщину покровного стекла, защищающего образец, которая, как предполагал разработчик, имеет постоянное значение, с поправкой на сферическую аберрацию. Цель будет выгравирована МАСЛО или OEL или HIесли объектив предназначен для работы с иммерсионным маслом. В противном случае объектив предназначен для использования всухую. На объективах также всегда выгравировано их числовое значение апертуры. Если объектив не показывает более высокую коррекцию, это, скорее всего, ахроматический объектив (более скорректированные объективы имеют такие надписи, как апохромат или апо, план, FL, флюор и т. Д.).

В течение нескольких лет большинство производителей придерживались международного стандарта парфокального расстояния при разработке линз для биологических применений. В результате большинство объективов имели парфокальное расстояние 45,0 мм и считались взаимозаменяемыми. Поскольку производство трубок с коррекцией на бесконечность стало обычным явлением, был создан новый набор критериев проектирования для коррекции аберраций в объективе и линзах трубки. Наряду с потребностью в большей гибкости для удовлетворения требований увеличения рабочих расстояний за счет более высоких числовых апертур и размеров поля взаимозаменяемость между линзами объектива от разных производителей теперь более ограничена.

В ситуациях, когда образец предназначен для визуализации без покровного стекла, рабочее расстояние измеряется на реальной поверхности образца. В серии согласованных объективов рабочее расстояние обычно уменьшается по мере увеличения увеличения и числовой апертуры. Объективы, предназначенные для просмотра образцов с воздухом в качестве среды формирования изображения, должны иметь сравнительно большие рабочие расстояния при условии выполнения требований к числовой апертуре. В качестве альтернативы иммерсионные объективы должны иметь меньшие рабочие расстояния, чтобы иммерсионная жидкость между передней линзой и образцом оставалась на месте. Многие объективы, разработанные с одинаковыми рабочими расстояниями, имеют подпружиненный стопор отвода, который позволяет извлекать переднюю линзу в сборе, вставляя ее в корпус объектива и поворачивая для фиксации на месте. Поворот ограничителя ретракции в обратном направлении освобождает сборку линзы для использования. В некоторых приложениях (см. Ниже) необходимо большое свободное рабочее расстояние, и для такого использования разработаны специальные объективы, несмотря на то, насколько сложно добиться больших числовых апертур и необходимой степени оптической коррекции.

Противоотражающие покрытия

Одним из наиболее значительных улучшений в конструкции объектива за последние годы является усовершенствование технологии антиотражающего покрытия, которое помогает уменьшить ненужные отражения, возникающие при прохождении света через систему линз. Каждая граница раздела воздух-стекло без покрытия способна отражать от четырех до пяти процентов падающего светового луча по нормали к поверхности, что дает значение пропускания 95–96 процентов при нормальном падении. Если нанести просветляющее покрытие толщиной в четверть длины волны с соответствующим показателем преломления, оно может увеличить это значение на три-четыре процента. Многослойные покрытия, которые обеспечивают значения пропускания, превышающие 99,9% в видимом спектральном диапазоне, заменили однослойные покрытия линз, которые когда-то использовались для уменьшения бликов и улучшения пропускания.

Резкое улучшение контрастности и пропускания видимых длин волн является результатом того, что большинство производителей микроскопов в настоящее время выпускают свои собственные запатентованные составы, наряду с одновременным разрушающим воздействием на гармонически связанные частоты, лежащие вне полосы пропускания. Микроскоп должен знать, что эти специализированные покрытия могут быть легко повреждены в результате неправильного обращения. Хорошее правило, которое следует использовать для различения покрытий, состоит в том, что многослойные просветляющие покрытия имеют слегка зеленоватый оттенок, в отличие от пурпурного оттенка однослойных покрытий. Кроме того, поверхностный слой антиотражающих покрытий, используемых на внутренних линзах, часто намного мягче, чем соответствующие покрытия. Особую осторожность следует соблюдать при очистке оптических поверхностей, покрытых тонкими пленками,

Расстояние от центра линзы до точки, в которой параллельные лучи фокусируются на оптической оси, определяется как фокусное расстояние системы линз. Воображаемая плоскость, перпендикулярная главной точке фокуса, называется фокальной плоскостью системы линз. Есть две основные точки фокусировки, одна спереди и одна сзади, для света, попадающего с каждой стороны каждой линзы. Обычно фокальная плоскость объектива, расположенная ближе к передней линзе, называется передней фокальной плоскостью, а фокальная плоскость, расположенная за объективом, называется задней фокальной плоскостью. Конкретное положение задней фокальной плоскости зависит от конструкции объектива, но обычно она располагается где-то внутри оправы объектива для объективов с большим увеличением. Объективы с меньшим увеличением часто имеют заднюю фокальную плоскость, расположенную снаружи,

Задняя апертура или выходной зрачок объектива ограничивают световые лучи, проходящие через объектив. Диаметр этой апертуры варьируется от 12 миллиметров для объективов с малым увеличением до примерно 5 миллиметров для апохроматических объективов максимальной мощности. Тщательный учет размера апертуры абсолютно необходим для применений эпи-освещения, которые полагаются на то, что объектив действует как система визуализации и конденсатор, где выходной зрачок также становится входным зрачком. Изображение источника света должно полностью заполнять заднюю апертуру объектива, чтобы обеспечить равномерное освещение по всему полю обзора. Если изображение источника света меньше диафрагмы, в поле обзора будет наблюдаться виньетирование из-за неравномерного освещения. И наоборот, если изображение источника света больше задней апертуры,

Большинство производимых сегодня объективов микроскопов имеют чрезвычайно низкие степени аберраций и других недостатков, при условии, что соответствующий объектив выбран и используется должным образом. Тем не менее, микроскопист должен осознавать тот факт, что объективы не созданы идеально с каждой точки зрения, а предназначены для удовлетворения определенного набора требований в зависимости от предполагаемого использования, ограничений по физическим размерам и диапазона цен. Следовательно, объективы изготавливаются со степенями коррекции, которые различаются для хроматической и сферической аберрации, размера поля и его плоскостности, длины волны пропускания, отсутствия флуоресценции, двулучепреломления и дополнительных факторов, влияющих на фоновый шум. Кроме того, они предназначены для использования в определенных ограниченных условиях,

Правильное обращение к микроскопу

Хотя обычная конструкция микроскопа не обязательно была проблемой для краткосрочного использования, длительные сеансы в прошлом создавали проблемы для ученых и техников, которые использовали инструменты. Чтобы просмотреть образцы и записать данные, операторы микроскопов должны принять необычное и сложное положение, с небольшой возможностью двигать головой или телом, и могут быть не в состоянии принять правильную позу, необходимую для избежания травм (см. Рисунок 1). Их часто заставляют принять неудобную позу, наклонив голову над глазными трубками, верхнюю часть тела наклонив вперед, высоко подняв руку для управления фокусировкой, а запястья согнуты в неестественном положении. Плохая осанка и неудобно позиционирование являются основными факторами риска развития заболеваний опорно - двигательного ( MSDS), которые могут повлиять на штатных микроскопистов, которые часто испытывают боль или травмы шеи, запястий, спины, плеч и рук.

Эргономика занимается поиском лучшего соответствия между людьми и тем, что они делают, объектами, которые они используют, и окружающей средой, в которой они живут, работают, путешествуют и играют. Это относительно новая отрасль науки, также известная как человеческая инженерия, которая была основана в 1949 году, отвергнутая развитием новых технологий во время Второй мировой войны. В течение этого периода стало ясно, что для безопасного и эффективного использования новых технологий и продуктов необходимо учитывать человеческие факторы и факторы окружающей среды.

Региональный опрос цитотехнологов (активных пользователей микроскопов) показал, что чуть более 70 процентов сообщили о симптомах в области шеи, плеч или верхней части спины, в то время как 56 процентов имели повышенную частоту симптомов со стороны кисти и запястья. Другие исследования показали, что примерно 80 процентов микроскопистов во всех сферах деятельности испытывали скелетно-мышечную боль, связанную с работой, и что 20 процентов пропускали работу из-за медицинских проблем, связанных с использованием микроскопа. Довольно высокий процент выбывания цитотехнологов в течение 5–10 лет частично объясняется физическим дискомфортом, связанным с долгими часами изучения образцов под микроскопом. Большинство сообщаемых проблем возникает с шеей, спиной, плечами и руками, но есть также процент микроскопистов, сообщающих о дискомфорте с глазами.

Усталость глаз

Усталость глаз может стать серьезной проблемой для операторов микроскопов, особенно если у них плохое зрение из-за близорукости или дальнозоркости или астигматизма. Если вы начинающий микроскопист, вы можете нервничать при просмотре. Вы думаете, что вам нужно настроить глаза на зрение вблизи, потому что, в конце концов, вы хотите увидеть что-то маленькое. Это неправильное отношение к микроскопии и в долгосрочной перспективе может вызвать у вас напряжение. Есть простое средство: сначала смотрите вдаль расслабленными глазами, а затем в окуляры, не меняя настройки глаз. Только после этого следует установить межзрачковое расстояние окуляров с помощью складывающейся перемычки, пока вы не увидите только один кружок вместо двух. Не забывайте сознательно использовать для просмотра оба глаза.

Регулировка диоптрий, предусмотренная на большинстве окуляров микроскопов, может использоваться для компенсации незначительных проблем с фокусировкой, но микроскописты с астигматизмом средней и тяжелой степени должны носить очки при просмотре образцов через окуляры. Чтобы приспособить более длинную точку зрения, необходимую для наблюдения через очки, производители предлагают специальные окуляры с высокой точкой зрения. Пользователи, которые не носят очков, также должны соблюдать это расстояние, чтобы весь свет от микроскопа попадал на радужную оболочку глаза (рис. 2). Если вы медленно двигаете головой вперед и назад перед окулярами, вы скоро найдете оптимальную расслабленную позу, которая позволит вам видеть весь круг поля зрения. Если вы не носите очки, вам пригодятся дополнительные резиновые колпачки на окулярах.

Пользователи очков, которым требуются простые линзы со сферической оптической силой, могут использовать микроскоп как в очках, так и без них, при условии, что диоптрийная установка фокусирующего окуляра достаточна. Однако, если вам требуются линзы с торической силой, например линзы, которые по-разному преломляют свет по горизонтали и вертикали, вам следует носить очки для микроскопии, так как ваш глаз имеет несимметричные аберрации, которые не могут быть компенсированы одной настройкой диоптрий. Вот как вы проверяете свои очки: смотрите на простую геометрическую фигуру, такую как круг или квадрат, через очки, которые вы сняли с глаз (см. Рисунок 3). Сначала вы держите очки горизонтально (Рисунок 3 (a), затем вертикально (Рисунок 3 (b) и 3 (c)). Если фигура кажется сжатой или растянутой из-за этого поворота примерно на 90 градусов (Рисунок 3 (b)),

При соблюдении вышеперечисленных правил зрительное напряжение будет сведено к минимуму при взгляде в окуляры микроскопа расслабленными глазами (аналогично наблюдению за объектом на большом расстоянии). Многие проблемы утомления глаз, которые развиваются при длительном использовании микроскопа, можно облегчить, используя системы видеокамер, которые отображают образец на мониторе компьютера. Однако без очков для чтения нужно приспособиться, чтобы четко видеть изображение на мониторе. В будущих конструкциях микроскопов можно будет полностью отказаться от окуляров, заменив вместо них классические тубусы на ПЗС- или КМОП-матрицу. Микросхема цифровой обработки изображений будет соединена со сложным пакетом программного обеспечения для анализа, который управляет захватом и хранением изображений, цифровой обработкой и другими функциями, такими как покадровая микрография и видеофильмы в реальном времени.

Обеспечение максимальной яркости, резкости и четкости изображений, полученных с микроскопа, также поможет снизить утомляемость глаз и связанные с этим головные боли. Важно обучить операторов правильному расположению лампы микроскопа и оптического пути для оптимизации качества изображения. Это верно независимо от того, наблюдается ли изображение через окуляры или на мониторе компьютера. Многие из новых микроскопов имеют расширенное поле обзора за счет использования окуляров с большей полевой диафрагмой. В сочетании с объективами с более высокими значениями числовой апертуры, улучшенной коррекцией аберраций и более длинными рабочими расстояниями полученные изображения демонстрируют огромное количество деталей образца с исключительной четкостью с плоскими полями от края до края. Эти факторы облегчают визуальный поиск крошечных деталей образца.

Защита микроскопа

Конструкция микроскопа часто (частично) оправдывает неправильное лечение. Тем не менее, передний носик объектива с чувствительной передней линзой является одной из особенно критических областей. Следует принять ряд мер предосторожности, чтобы не повредить линзу объектива. Вся передняя оптика объективов с большим увеличением (в большинстве случаев) заключена в упругую подпружиненную опору. При прикосновении это крепление немного отступает (рис. 4). Однако расстояние, доступное для этого механизма, очень мало (примерно 2-3 миллиметра). Поэтому убедитесь, что вы не перемещаете столик слишком высоко во время фокусировки. В таких случаях образец будет давить на наконечник объектива, и если передняя линза больше не сможет отступить, это может привести к дорогостоящему разрушению стекла. Иммерсионные объективы имеют дополнительную защиту по сравнению с описанной выше. Некоторые варианты можно зафиксировать в крайнем верхнем положении, осторожно повернув корпус передней группы линз (носик). Таким образом, объективы можно припарковать на безопасном расстоянии. С другой стороны, описанный выше путь эвакуации больше не доступен, и если кто-то попытается использовать объектив в этом втянутом режиме, изображение будет искажено, и возникнет опасность столкновения ступени с другими объектами, когда револьвер турель поворачивается.

Помимо защиты объектива, важно защитить весь микроскоп (когда он не используется) прилагаемой пылезащитной крышкой (см. Рисунок 5). Микроскопы используются в среднем 15 лет или дольше. Так же, как ржавчина поражает автомобиль, проблема микроскопов - пыль, которая присутствует почти повсюду и увеличивается вместе с образцом.

Человеческое тело может выдерживать неподвижное положение в течение длительных периодов времени, если оно находится в нейтральной позе тела - положение, которое можно поддерживать без согласованных усилий или искажений. Нейтральная поза тела важна для эффективной и результативной работы за микроскопом в течение долгих часов. Поскольку не каждый может купить новый микроскоп или рабочую станцию с эргономичным дизайном, самая разумная идея состоит в том, чтобы найти способ модифицировать микроскоп, чтобы он соответствовал потребностям пользователя, а не заставлять пользователя принимать неудобные положения. Вот несколько основных рекомендаций по достижению и поддержанию нейтральной позы тела при использовании микроскопа:

Глаза - окуляры должны располагаться чуть ниже глаз так, чтобы глаза смотрели вниз под углом от 30 до 45 градусов над горизонтом; Расстояние между зрачками бинокулярных окуляров следует отрегулировать, чтобы обеспечить удобную фокусировку обоими глазами.
Шея - шея и голова должны сгибаться как можно меньше, желательно не более чем на 10-15 градусов ниже горизонтали.
Назад - человек должен сидеть полностью вертикально, опираясь на все тело немного вперед с нижней части спины и лопаток , поддерживаемых стула и / или поясничной поддержки подушки. Сидение в течение длительного времени создает чрезмерную нагрузку на нижнюю часть спины, которую можно уменьшить с помощью надлежащей поддержки.
Руки / запястья - предплечья должны быть перпендикулярны полу, локти прижаты к корпусу (не выпуклые и не торчащие), предплечья параллельны полу; запястья должны быть прямыми.
Ноги - ступни должны твердо опираться на пол или подставку для ног, стул должен равномерно надавливать на тыльную сторону бедер.

Для дальнейшего снижения факторов эргономического риска

Развивайте осознание осанки. При сидении старайтесь сохранять естественный изгиб поясницы. При необходимости используйте дополнительную поясничную опору.
Если ножное кольцо на лабораторном стуле расположено слишком низко, поднимите его, чтобы нижняя часть спины поддерживалась спинкой стула. Нередко ножки-колодцы лабораторных стендов используются как хранилища для редко используемого оборудования и дополнительных принадлежностей. Очистите это место, чтобы не мешали ногам и ступням сидеть на скамейке.
Не наклоняйтесь вперед, чтобы смотреть в микроскоп. Вместо этого отрегулируйте положение стула, рабочей станции или микроскопа, чтобы спина была прямой, а голова - вертикальной. Окуляры должны располагаться на одной линии с краем скамьи или даже выступать над ним.
Если микроскоп расположен слишком низко, поднимите его, подложив под него книгу, или измените конфигурацию с помощью оригинального производителя оборудования (OEM) или дополнительных принадлежностей, чтобы голова оставалась вертикальной.
Отрегулируйте высоту микроскопа, скамейки или стула так, чтобы шея не сгибалась и не вытягивалась, а подбородок не выступал вперед. Если оператор стоит стоя, на его рабочем месте должны быть установлены противоутомные коврики, чтобы уменьшить нагрузку на ступни, ноги и поясницу.
Избегайте контактного напряжения предплечий, лежащих на острых краях скамейки или встречных краев, добавив мягкие защитные приспособления для краев.
Убедитесь, что оптическая система микроскопа настроена правильно, а источник освещения выровнен и работает оптимально.
Проверьте лабораторную среду на предмет чрезмерного ослепления и отражений от верхнего люминесцентного освещения и отрегулируйте внешний и внутренний свет микроскопа для компенсации.

Одной из опасений должностных лиц Управления по охране труда (OSHA) является то, что фундаментальная информация об общих МСД, факторах риска и важности сообщения о симптомах должна быть предоставлена сотрудникам, которые вынуждены проводить большую часть своего рабочего дня за микроскопом. Хотя многие из требований эргономики в настоящее время решаются производителями микроскопов, существует значительное количество микроскопов, которые не оснащены надлежащим оборудованием для обеспечения комфорта рабочего и снижения вероятности травм. Работодатели должны беспокоиться о возможных медицинских проблемах, которые могут возникнуть в результате длительного использования микроскопа. Принадлежности для вторичного рынка, которые доступны для широкого спектра микроскопов, могут временно стать решением для большинства старых инструментов. Однако,

Практика

Независимо от того, насколько плохо используется микроскоп, прибор почти всегда способен производить изображение, хотя результаты могут оставлять желать лучшего. Если следовать определенным простым рекомендациям, новичок сможет быстро получить изображение высокого качества. На самом деле, вы можете быть удивлены тем, насколько легко правильно настроить микроскоп, чтобы получать красивые и четкие изображения. Интенсивное изучение любого образца может быть трудоемким процессом и требует значительного терпения, поэтому перед началом убедитесь, что вы находитесь в удобном положении и можете смотреть в окуляры микроскопа, не напрягая шею или согните спину. Также, попробуйте положить предплечья на стол, чтобы с легкостью и комфортом управлять движениями предметного столика микроскопа и органами управления фокусировкой. Помните, что при длительных сеансах за микроскопом всегда принимайте удобную позу перед началом наблюдений.

При чтении следующих инструкций имейте в виду, что, поскольку доступно такое большое разнообразие моделей микроскопов, невозможно охватить все детали и исключения для каждой конкретной модели в одном разделе. Пользователь должен всегда обращаться к руководству по эксплуатации конкретного микроскопа, который используется. Следующие ниже рекомендации дополняют общий план и обеспечивают базовую основу для настройки типичного микроскопа для использования с проходящим светом и освещением Келера.

еще раз про Кёлер

Наиболее важным аспектом настройки микроскопа для получения максимального качества изображений является оптимизация оптической системы в соответствии с теорией освещения Келера. Следующие советы помогут правильно настроить микроскоп.

Сначала поместите окрашенный образец на предметный столик и вращайте револьверную головку, пока объектив (предпочтительно с 10-кратным или 20-кратным увеличением) не окажется на месте. Включите источник света. Откройте все диафрагмы до упора и поднимите конденсатор до упора.
Проверьте межглазное расстояние окулярных тубусов, если микроскоп имеет бинокулярную насадку, и при необходимости переустановите.
Сфокусируйте образец с помощью грубой настройки фокуса. Наилучший способ добиться этого - сначала подвести переднюю часть объектива примерно на 5 мм от поверхности предметного стекла. Сожмите диафрагму светового поля, а затем, глядя в окуляры, увеличивайте расстояние между образцом и объективом, пока изображение не станет резким. Выполните окончательную настройку с помощью ручки точной фокусировки.
Если вы используете бинокулярный микроскоп, может потребоваться отрегулировать отдельные окуляры в соответствии с вашим зрением. По крайней мере, один окуляр будет иметь регулировочную втулку. Чтобы сфокусировать этот инструмент, сначала держите один глаз закрытым (глаз, который смотрит через регулируемый окуляр), а другим глазом сфокусируйте микроскоп на определенной детали изображения. Теперь откройте другой глаз и сфокусируйте регулируемый окуляр, поворачивая его воротник, пока та же деталь не станет такой же резкой, как и раньше.
Убедитесь, что осветительная апертурная диафрагма (ирисовая диафрагма конденсатора) широко открыта. Частично закройте диафрагму освещенного поля до тех пор, пока ее изображение, которое, скорее всего, будет нечетким и, возможно, не по центру, не появится в поле зрения.
Максимально увеличьте резкость изображения освещенной полевой диафрагмы, изменяя фокусировку конденсора. Если вы работаете с конденсатором Аббе, цветные ореолы неизбежно будут обрамлять изображение. С другой стороны, апланатический и ахроматический конденсаторы обеспечат более четкое изображение полевой диафрагмы.
При необходимости отцентрируйте изображение освещенной полевой диафрагмы. Вам будет проще сделать это, если диаметр изображения полевой диафрагмы будет лежать почти поверх изображения поля зрения. Система освещения, включая освещенную диафрагму поля, выравнивается на большинстве микроскопов во время производства, а изображение диафрагмы поля центрируется с помощью центрирующих винтов конденсора. Во многих случаях диафрагму можно отрегулировать с помощью собственных центрирующих винтов.
Откройте диафрагму освещенного поля, пока не станет ярким все поле зрения.
Снимите один из окуляров и осмотрите заднюю фокальную плоскость объектива. Если имеется лупа, снабженная наборами фазового контраста (часто называемая фазовым телескопом ), используйте этот инструмент в качестве вспомогательного средства для просмотра фокальной плоскости. Закройте осветительную апертурную диафрагму в конденсоре до тех пор, пока ее изображение не начнет появляться на освещенной области в задней фокальной плоскости.
Установите на место окуляр и отрегулируйте интенсивность света до достаточного уровня с помощью регулятора яркости или вставив фильтры нейтральной плотности на путь луча.

Теперь микроскоп правильно настроен для получения наилучших изображений, которые он способен производить. Если используемый объектив не исправлен должным образом, то может потребоваться (к тому времени, когда вы снимете один из окуляров), чтобы взглянуть на заднюю фокальную плоскость, чтобы немного закрыть освещающую диафрагму, чтобы получить удовлетворительное изображение. Со старыми объективами, возможно, подойдет уменьшение рабочей апертуры объектива даже на треть его диаметра. В этих обстоятельствах опыт будет вашим лучшим руководством.

Объективы как использовать?

Объективы с малым и большим увеличением отличаются, прежде всего, тем, что последние имеют гораздо большую числовую апертуру и, следовательно, большую разрешающую способность. Следовательно, при переключении с малой мощности на большую необходимо открывать ирисовую диафрагму осветительной диафрагмы конденсора, чтобы большой угол светового конуса обеспечивал адекватное разрешение деталей. Совершенно необходимо, чтобы каждый объектив работал с конусом конденсатора, достаточно большим, чтобы заполнять от 70 до 90 процентов апертуры линзы объектива (см. Рисунок 2 (b)). Если апертура конденсатора дает слишком маленький световой конус (рис. 2 (c)), результатом будет плохое изображение с отсутствием деталей, с дифракционными ореолами вокруг деталей объекта. Когда вы вернетесь к использованию цели с меньшим увеличением, настройку следует изменить.

Целесообразно наблюдать как можно больше деталей образца при малом увеличении. Такой подход позволит наблюдателю более легко соотнести форму и структуру образца с деталями, которые можно увидеть невооруженным глазом или простым ручным объективом. Как только вы соберете всю информацию, которую можно получить от одной силы, переходите к следующей более высокой власти. Важно действовать упорядоченно, особенно для тех, кто только начинает пользоваться микроскопом. Начинающие студенты часто слишком поспешно переходят к высшим способностям, что делает их задачу интерпретации структуры образца гораздо более сложной, чем она должна быть.

При использовании маломощного объектива, например объектива с увеличением в диапазоне 4x, важно, чтобы числовая апертура конденсора соответствовала апертуре объектива. Возможно, что конденсор не будет освещать все поле зрения, даже когда полевая диафрагма полностью открыта. В этой ситуации вы должны либо выключить конденсор на одно из более длинных фокусных расстояний, либо снять верхнюю линзу конденсора (иногда по этой причине она предназначена для вращения вне оптической оси). Когда используются специальные объективы, рассчитанные на увеличение 1x или 1.5x, для успеха жизненно важен соответствующий конденсор.

Если вы исследуете мелкие детали, близкие к пределу разрешения, используются масляно-иммерсионные объективы с числовой апертурой больше 1. Оптимальная методика следующая:

Установите интересующую точку с объективом с меньшим увеличением и отцентрируйте ее в поле зрения и фокусе.
Нанесите одну каплю иммерсионного масла на верхнюю часть покровного стекла и, если вы используете современные парфокальные объективы, медленно поверните масляный иммерсионный объектив на место. Убедитесь, что на переднюю линзу попала капля масла.
Посмотрев в микроскоп, убедитесь, что препарат находится относительно в фокусе, а затем используйте точную фокусировку для увеличения резкости изображения.
Если между конденсатором и золотником не используется масло, убедитесь, что апертурная ирисовая диафрагма конденсатора полностью открыта. В этом случае масляно-иммерсионный объектив не может работать с максимальной апертурой для освещения, поскольку конденсор может создавать только конус освещения, имеющий максимальную числовую апертуру около 0,9. Хотя это требуется редко, но если необходимо достичь максимально возможного разрешения в проходящем свете от масляно-иммерсионного объектива с очень большой числовой апертурой, то верхняя линза конденсора также должна быть смазана маслом на нижней стороне предметного стекла ( необходим специальный высокоапертурный масляный иммерсионный конденсатор). После фокусировки конденсора его диафрагма регулируется так, чтобы она была равна апертуре объектива.

Освещение по Келеру требует, чтобы освещалась только небольшая область образца, которая фактически является фокусом наблюдения, поскольку любой чрезмерный свет за пределами поля зрения отвлекает. В то же время при увеличении увеличения объективов размер апертуры освещенного поля должен уменьшаться. В противном случае изображение будет ухудшено из-за бликов, особенно при использовании методов падающего (отраженного) света. Еще одна возможная ошибка, которая приводит к плохому изображению, - это игнорирование наличия пузырьков в капле иммерсионного масла. Чтобы этого не произошло, снимите окуляр и наблюдайте за задней фокальной плоскостью объектива, затем переместите слайд вперед и назад или частично поверните револьверную головку, чтобы выбить пузырьки. Если вам не удалось очистить пузыри с помощью этих приемов,

Систему микроскопа можно настроить так, чтобы она была парфокальной (требуются два фокусирующих окуляра) для простоты использования при смене объективов. Самая простая процедура включает настройку камеры для получения изображений, а затем фокусировку образца с помощью монитора компьютера, чтобы определить, какое значение дает наиболее резкое изображение. Затем отрегулируйте оба окуляра до тех пор, пока в каждый окуляр не будет четкого изображения. Если на микроскопе нет камеры, переключитесь на объектив с максимальным увеличением и осторожно сфокусируйтесь, используя ручки фокусировки. Переключитесь на объектив с наименьшим увеличением (оставив фокус без изменения), а затем повторно сфокусируйте окуляры.

1190 views·6 shares

1190 views