Carl Zeiss ДИК по Nomarski

Автор: Dr. Walter Lang, научный сотрудник CARL ZEISS, Oberkochen.

I. Основы и экспериментальные разработки

С 1965 года компания CARL ZEISS из Оберкохена поставляет оборудование для интерференционного контраста в проходящем свете, а с 1967 года – в отраженном свете. Оба оборудования были разработаны по предложениям профессора G.Nomarski. Это оборудование было разработано в тесном сотрудничестве с Nomarski и за это время показало превосходные результаты в различных применениях оптических методов интерференционного контраста.

Все более широкое распространение и применение дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии по Nomarski требует всестороннего описания этого метода. Это первая часть статьи, посвященной данной теме, и в ней рассматриваются физические принципы метода и разработанное для него оборудование. Во второй статье будут рассмотрены формирование и интерпретация изображения, полученного с помощью дифференциально-интерференционного контраста. Оба эти аспекта послужат основой для сравнения дифференциально-интерференционного контраста по Nomarski с фазово-контрастным, которое будет представлено в третьей статье. Наконец, в четвертой статье будут рассмотрены применения дифференциально-интерференционного контраста по Nomarski. Для облегчения понимания мы избегаем математических объяснений. Тем не менее, для читателей, желающих продолжить изучение этой темы, приведены многочисленные ссылки.

Сначала будет объяснен принцип интерференционно-контрастной микроскопии. Затем будут рассмотрены наиболее существенные различия между интерференционными методами Jamin-Lebedeff и Nomarski. Это позволит кратко изложить основные термины, используемые в кристаллооптике и необходимые для понимания принципов работы этих двух методов. Описывается конструкция интерференционно-контрастного микроскопа Nomarski для проходящего света для двух различных методов: один для двухлучевой интерференционной микроскопии, другой для компенсации интерференционных полос. Оба метода также применимы для описания оборудования для работы с отраженным светом.

1. Основные принципы интерференционно-контрастной микроскопии

Если в интерференционном микроскопе расстояние между полосами (и, следовательно, ширина полос) делается настолько большим, что одна полоса покрывает всё поле зрения, мы говорим о бесконечном распространении этой интерференционной полосы или об интерференционном контрасте. Тем самым интересующая область образца становится видимой благодаря интерференционному контрасту (6, 7, 8, 18, 23, 30). Это можно пояснить с помощью микрофотографий, показанных на рис. 1, которые были сделаны в отраженном свете на интерференционном микроскопе фирмы CARL ZEISS, Oberkochen. Этот прибор, как правило, настроен таким образом, чтобы интерференционные полосы были видны в поле зрения. В отраженном свете расстояние между полосами соответствует половине длины волны используемого монохроматического света. Разности хода, выраженные в долях или кратных половине длины волны используемого света и обусловленные неровностями структуры поверхности образца, приводят к смещению полос. Величина сдвига полос прямо пропорциональна разности хода.

На микрофотографии слева на рис. 1 расстояние между полосами очень мало; следовательно, смещение полос также мало, но полосы хорошо различимы и имеют относительно чёткие контуры. Микрофотография в центре иллюстрирует переходную стадию между конечным и бесконечным расстоянием между полосами: в поле зрения видны только пять интерференционных полос (по сравнению с 14 на предыдущей микрофотографии). Здесь разность хода, или сдвиг, также выражается в долях половины длины волны используемого света. Однако также очевидно, что края полос более или менее «размыты». На микрофотографии справа, наконец, расстояние между двумя соседними полосами больше поля зрения. Здесь мы говорим о бесконечно большом расстоянии между полосами или, в соответствии с данным выше определением, об интерференционном контрасте. Сравнение с двумя другими микрофотографиями ясно показывает, что в случае интерференционного контраста разности хода преобразуются в разности яркости. Это повышает чёткость микроскопического изображения, которое благодаря определённому эффекту тени кажется почти трёхмерным. С другой стороны, становится очевидным, что разность хода лучей уже не может быть легко определена, поскольку в интерференционном контрасте нет измеряемого сдвига полос.

2. Принцип работы двухлучевых интерференционных микроскопов ZEISS

Компания CARL ZEISS из Oberkochen (ФРГ) производит три различных двухлучевых интерференционных микроскопа: типа Michelson, Jamin-Lebedeff и Nomarski. Микроскоп Michelson, который использовался для получения микрофотографий, представленных на рис. 1, отличается большим расстоянием между пучками образца и опорного луча 1, которое может достигать нескольких сантиметров. В интерференционном микроскопе Jamin-Lebedeff боковое расстояние между опорным и образцом значительно меньше, а именно несколько миллиметров (см. ниже). Наконец, в интерференционном микроскопе Nomarski боковое расстояние между двумя пучками составляет всего несколько микрометров, то есть немного меньше разрешающей способности микроскопа. В этом случае мы говорим о дифференциальном разделении пучков. В двухлучевых интерференционных микроскопах величина расщепления пучка имеет большое значение для интерференционного изображения и позволяет выделить ещё один тип двухлучевых микроскопов: в случае микроскопа типа Michelson мы всегда можем предположить, что опорный пучок не подвержен влиянию образца. В интерференционных микроскопах типа Jamin-Lebedeff опорный пучок не подвержен влиянию образца только в том случае, если исследуемый образец меньше расстояния между двумя пучками. Однако, если рассматривать дифференциальное расщепление пучков, как в случае интерференционного микроскопа Nomarski, термины «пучок образца» и «опорный пучок» теряют смысл, поскольку оба пучка проходят через микроскопический образец. Другими словами, при дифференциальном расщеплении пучка оба пучка подвержены влиянию образца, что необходимо учитывать при интерпретации интерференционного изображения.

Помимо вышеупомянутых различий, существующих в двухлучевых интерференционных микроскопах, существует ещё одна отличительная особенность — расщепление и рекомбинация пучка. В интерференционном микроскопе типа Michelson используется светоделительная призма. (Подробнее см. 11, 13, 16, 17, 28, 35, 36, 37, 40 и 41). В двухлучевых интерференционных микроскопах Jamin-Lebedeff и Nomarski, напротив, лучи расщепляются и рекомбинируются двулучепреломляющими кристаллами. Двулучепреломляющие или двупреломляющие кристаллы (3, 4, 23, 34) – это кристаллы, которые расщепляют падающую световую волну на две компоненты, плоскополяризованные, плоскости колебаний которых перпендикулярны друг другу. Рис. 2 может служить пояснением. Он также иллюстрирует принцип расщепления волн в микроскопе Jamin-Lebedeff. Предположим, что световая волна, на диаграмме которой показана только ось, падает перпендикулярно на плоскопараллельную пластину кальцита. Кроме того, мы предполагаем, что падающая волна плоскополяризована и плоскость ее колебаний наклонена на 45° к плоскости диаграммы. Оптическая ось пластины кальцита 2, отмеченная двойной стрелкой, проходит параллельно плоскости диаграммы. Когда луч входит в кристалл, волна разделяется на две части, оси которых вписаны в диаграмму как главное сечение 3. Так называемая обыкновенная волна проходит через кристалл без какого-либо отклонения. Так называемая необыкновенная волна отклоняется в одну сторону, несмотря на ее вертикальное (90°) падение на плоскопараллельную пластину. Она выходит из кристалла параллельно оси обыкновенной волны. Если известно направление, в котором срезан кристалл, разделение между двумя волнами является функцией толщины кристаллической пластины. В случае интерференционного прибора ZEISS Jamin-Lebedelf, работающего в проходящем свете, он составляет минимум 0,05 мм (Achromat Pol Int., 100x, 1,0 N. A., 011) и максимум 0,5 мм (Achromat Pol Int., 10x, 0,22 N. A.). Как видно из рис. 2, двулучепреломляющая пластинка, помимо бокового расщепления пучка, характеризуется ещё одной особенностью. Плоскопараллельная световая волна, падающая на кристалл и направленная под углом 45° к плоскости диаграммы, расщепляется на две плоскополяризованные компоненты. Направление колебаний обыкновенной волны перпендикулярно плоскости диаграммы, в то время как направление колебаний необыкновенной волны совпадает с плоскостью диаграммы. Этот факт необходимо учитывать при проектировании интерференционного микроскопа Jamin-Lebedeff, поскольку после рекомбинации два когерентных пучка могут интерферировать и создавать интерференционное изображение только в том случае, если направления колебаний двух плоскополяризованных волн лежат в одной плоскости 4.

Аналогичные соображения применимы и к дифференциальному интерференционному микроскопу Номарского. Они имеют решающее значение не только для формирования, но и для интерпретации интерференционного изображения.

1. Под образцом или измерительным пучком мы понимаем пучок когерентного света, проходящий через образец. Второй когерентный пучок, называемый опорным или сравнительным, не проходит через образец, а обходит его.

2. Оптическая ось двулучепреломляющего кристалла указывает направление, в котором совпадают обыкновенная и необыкновенная волны. Это направление, в котором кристалл ведет себя как изотропная, т.е. не двупреломляющая среда, также называется левотропной осью. В случае кальцита и кварца она совпадает с оптической осью кристалла. Кристаллы с одной оптической осью, например, кальцит или кварц, называются одноосными кристаллами.

3. Любая плоскость, проходящая через кристаллографическую ось, является главным сечением кристалла.

(Следуя общепринятому термину, термин «пучок», взятый из геометрической оптики, здесь и далее часто используется вместо более подходящих терминов «пучок лучей» или «световая волна»).

4. Термин «плоскость поляризации» (плоскость, перпендикулярная направлению колебаний электрического вектора), используемый в более ранней литературе, может быть опущен и в данной статье не используется.

Поэтому расщепление плоскополяризованной волны на две плоскополяризованные компоненты с различными направлениями колебаний будет рассмотрено более подробно (см. также 6, 21, 22, 34). Противоположный процесс, а именно рекомбинация двух плоскополяризованных компонент в плоскополяризованную волну, будет рассмотрен в связи с интерпретацией дифференциально-интерференционного изображения.

Направление колебаний плоскополяризованной световой волны совпадает с плоскостью, в которой колеблется вектор напряжённости электрического поля E. В соответствии с правилами векторного исчисления, вектор E можно разбить на два вектора, e1 и e2, перпендикулярных друг другу, каждый из которых образует с E угол 45° (рис. 3).

Если применить этот формализм к плоскополяризованной световой волне, электрический вектор которой изменяется синусоидально со временем, получим диаграммное изображение на рис. 4: оно показывает синусоиду (центральная кривая), исходящую из левого переднего плана в правый задний; колебания, представленные двумя наклонными кривыми, эквивалентны ей.

Выбранная на рис. 5 форма представления особенно удобна для интерпретации изображения, полученного методом дифференциальной интерференционно-контрастной обработки. Она суммирует наиболее существенные результаты рис. 3 и 4. Пусть W (а) – плоскополяризованная волна, нормальная к плоскости диаграммы. Следуя схеме рис. 3, эту волну с векторами E и E' (б) можно разложить на компоненты w1 и w2 с векторами e1, e1' и e2, e2'. На (c) плоскость колебаний волны W совпадает с плоскостью диаграммы.

Как упоминалось выше, в интерференционном микроскопе Jamin-Lebedeff с помощью двупреломляющей плоскопараллельной пластины достигается сильный эффект бокового разделения пучка. (Вопросы рекомбинации и компенсации пучка здесь обсуждаться не могут. За дополнительной информацией заинтересованные читатели могут обратиться к соответствующей литературе: 9, 10, 14, 20, 23. Многочисленные ссылки см. в разделе 25).

Если вместо двупреломляющей плоскопараллельной пластины в качестве делителя пучка использовать так называемую призму Волластона, то разделение пучка будет не боковым, а угловым (рис. 6). Призма Волластона состоит из двух склеенных между собой призм, изготовленных из двупреломляющего одноосного материала (предпочтительно кварца или кальцита). Оптические оси двух призм расположены под прямым углом друг к другу. Если плоскополяризованный пучок света (плоскость колебаний наклонена на 45° к плоскости чертежа) падает на призму Волластона перпендикулярно, как показано на рис. 6, он разделится на две плоскополяризованные волны в нижней призме, плоскости колебаний которых составляют угол 45° с падающей волной (см. рис. 3 и 5). На склеенной поверхности призмы Волластона две составляющие волны отклоняются в двух направлениях на определенный, относительно малый угол. Обыкновенная волна 5 отклоняется к основанию верхней призмы, в то время как необыкновенная волна 5 отклоняется к краю верхней призмы. Два составляющих луча встречают разные показатели преломления, так что волновые фронты движутся с разной скоростью.

5. Обыкновенная волна – это составляющая колебания, перпендикулярная плоскости главного сечения кристалла. Напротив, необыкновенная волна колеблется параллельно плоскости главного сечения. Поскольку призма Волластона состоит из двух призменных элементов, оптические оси которых образуют угол 90°, она имеет две различные, взаимно перпендикулярные главные плоскости. Более того, поскольку направление колебаний обеих составляющих полностью сохраняется на пути от нижней призмы к верхней, обыкновенная волна нижней призмы становится необыкновенной волной в верхней призме, а необыкновенная волна нижней призмы – обыкновенной волной в верхней призме.

3. Двухлучевой интерференционно-контрастный микроскоп с двумя призмами Волластона

Исходя из пояснений, данных в предыдущем разделе, конструкцию двухлучевого интерференционно-контрастного микроскопа можно легко пояснить с помощью рис. 7 (см. также 5, 8, 30, 31, 32). Неполяризованный свет, выходящий из полевой диафрагмы, плоскополяризуется поляризатором и попадает на первую призму Волластона. Как было объяснено выше, угловое расщепление пучка происходит на склеенной поверхности этой призмы. (Для большей наглядности один из сегментов призмы заштрихован). Если центральная плоскость призмы Волластона лежит в фокальной плоскости конденсора со стороны лампы, то после выхода из конденсора два пучка будут проходить по параллельным траекториям, слегка разнесенными вбок относительно друг друга. Они проходят через образец и объектив микроскопа и сходятся в фокальной плоскости объектива микроскопа со стороны изображения. Здесь расположена вторая призма Волластона, имеющая те же размеры и оптические свойства, что и первая. Вместе с объективом микроскопа вторая призма воссоединяет два луча. После выхода из второй призмы Волластона два компонента снова образуют один пучок, но они по-прежнему плоскополяризованы, а их плоскости колебаний расположены под прямым углом друг к другу. Чтобы две волны могли создать желаемый эффект интерференции в промежуточной плоскости изображения, их плоскости колебаний должны совпадать. Этого можно добиться, вставив анализатор в световой тракт. Диаграмма на рис. 5 показывает два компонента, теперь воссоединённых в одну плоскополяризованную волну, способную к интерференции. Полученное интерференционное промежуточное изображение можно наблюдать через окуляр обычным способом.

В то время как рис. 7 просто показывает принцип разделения и рекомбинации пучка, диаграмма рис. 8 также указывает направления колебаний поляризованных компонент в различных точках вдоль их пути. Рис. 8 показывает только оси световых пучков. Поляризатор ориентирован таким образом, что естественный свет, выходящий из полевой диафрагмы (не показана), является плоскополяризованным, а плоскость его колебаний наклонена на 45° к плоскости диаграммы. В нижней части призмы Волластона поляризованная волна, входящая в нее, расщепляется на две плоскополяризованные компоненты. Колебания пунктирного пучка перпендикулярны плоскости диаграммы, колебания перекрещивающегося пучка параллельны плоскости диаграммы. Обе компоненты пучка проходят через образец параллельно друг другу и на небольшом расстоянии друг от друга.

Над плоскостью образца две компоненты пучка рекомбинируются с помощью объектива микроскопа и второй призмы Волластона. Очевидно, что конденсор с первой призмой Волластона и объектив со второй призмой Волластона функционально коррелированы. Анализатор ориентирован таким образом, чтобы образовывать угол 45° с плоскостью колебаний каждой из входящих волн. В соответствии с рис. 4 и 5, это обеспечивает одинаковую интенсивность обеих компонент пучка. Что происходит, когда анализатор образует угол, отличный от 45°, с двумя компонентами пучка, будет подробно обсуждаться в связи с интерпретацией дифференциально-интерференционно-контрастного изображения.

В оборудовании для проходящего света необходимы две призмы Волластона для разделения и рекомбинации пучка, тогда как для установки отраженного света требуется только одна призма Волластона, поскольку свет проходит через призму дважды в противоположных направлениях (30, 31, 32). Разделение пучка при первом прохождении через призму компенсируется при втором прохождении. Другими словами, когда луч проходит через призму первый раз, объектив отраженного света и призма Волластона действуют так же, как конденсор и первая призма Волластона в установке проходящего света, показанной на рис. 7 и 8, в то время как при втором прохождении через призму эти компоненты соответствуют объективу и второй призме Волластона на этих рисунках. Это показано на схеме на рис. 9: луч, плоскополяризованный поляризатором, отклоняется к призме Волластона полупосеребренным зеркалом. Два компонента пучка выходят из объектива отраженного света параллельно друг другу и с небольшим боковым разносом. Лучи, отраженные от образца, затем рекомбинируются с помощью объектива и призмы Волластона, проходят через полупрозрачное зеркало и с помощью анализатора заставляют колебаться в одной плоскости. Интерференционно-контрастное изображение образца формируется обычным способом в промежуточной плоскости изображения (не показана) и наблюдается через окуляр.

Что касается диаграммы на рис. 9, следует отметить, что луч, проходящий через поляризатор, наклонен на 45° к плоскости диаграммы. Поэтому поляризатор следует представлять себе лежащим ниже плоскости чертежа. По этой причине, а также из-за перспективного вида, направления колебаний поляризованных компонентов не указаны. Однако, в принципе, условия аналогичны показанным на рис. 7 и 8 для проходящего света.

4. Двухлучевой интерференционно-контрастный микроскоп Nomarski

Вышеизложенное было посвящено, главным образом, конструкции и работе двулучепреломляющих компонентов, используемых для разделения и рекомбинации пучков, при этом ничего не говорилось о влиянии образца на пучки. Этот вопрос будет обсуждаться вместе с формированием и интерпретацией интерференционно-контрастного изображения во второй статье, которая будет опубликована по этой теме в данном журнале. Теперь рассмотрим, каким требованиям должна отвечать оптическая система формирования изображения.

При обсуждении двухлучевого интерференционно-контрастного микроскопа с двумя призмами Волластона для проходящего света мы предполагали, что фокальная плоскость конденсора со стороны лампы и фокальная плоскость объектива со стороны окуляра расположены в центральных плоскостях призм Волластона (8, 15, 30, 31, 32). Кроме того, мы предполагали, что интерференционные плоскости призм Волластона, совпадающие с их центральными плоскостями (параллельными верхней и нижней поверхностям призмы), точно совмещены. Выполнение этих требований представляет собой фундаментальную трудность: у объективов высокой мощности фокальная плоскость со стороны изображения находится в объективе, под посадочным местом для резьбы, поэтому призма Волластона не может быть расположена в этой плоскости. Это в равной степени применимо как к объективам проходящего, так и к объективам отраженного света. Однако конденсоры проходящего света с высокой числовой апертурой и, соответственно, малым фокусным расстоянием не позволяют расположить призму Волластона в своей передней фокальной плоскости (то есть сбоку от источника света). В результате дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия с использованием призм Волластона ограничена очень малыми увеличениями (30).

Весьма изящным и технически осуществимым решением этих проблем стало введение модифицированной призмы Волластона Normaski, которая в дальнейшем будет кратко называться «призмой Normaski». Эта призма (рис. 10) состоит из двух склеенных компонентов одноосного двупреломляющего кристалла, например, кальцита или кварца. Оптическая ось одной из этих призм (нижней на рис. 10) параллельна грани клина, как у призмы Волластона. Оптическая ось другой призмы (верхней на рис. 10), однако, наклонена под определённым углом к верхней ограничивающей грани. В результате плоскость интерференции находится вне составной призмы (пунктирная линия на рис. 10). При соответствующей ориентации призмы Normaski её плоскость интерференции можно расположить в фокальной плоскости объектива со стороны окуляра, хотя сама призма Normaski расположена на относительно большом расстоянии от объектива. Это имеет большое значение для конструкции дифференциально-интерференционно-контрастного микроскопа: поскольку парфокальное расстояние объективов, то есть расстояние между плоскостью предмета и посадочным местом объектива, задано и постоянно, призму Normaski можно также установить на заданном расстоянии от объектива, например, в интерференционно-контрастном слайде. Более того, если положение фокальной плоскости используемых объективов со стороны окуляра лишь незначительно отклоняется в осевом направлении от определённого среднего значения, одной призмы Normaski будет достаточно для объединения лучей всех имеющихся объективов проходящего света. В интерференционно-контрастном микроскопе ZEISS для проходящего света используется одна и та же призма Normaski, то есть один и тот же интерференционно-контрастный слайд 6, для объективов 16x, 40x и 100x. По этой причине – и по другим причинам, которые здесь не могут быть подробно изложены – она называется главной призмой, чтобы отличать её от так называемых вторичных призм, установленных в конденсоре подпредметного столика. В приборах ZEISS проходящего света используются три вторичные призмы, которые находятся в ахроматически-апланатическом конденсоре (тип VZ) для интерференционного контраста, фазового контраста и светлого поля и обозначены как I, II и III. Подобно различным размерам кольцевых конденсорных диафрагм для фазового контраста, вторичные призмы конденсора адаптированы к числовой апертуре (и начальному увеличению) используемых объективов.

6. Тот факт, что интерференционно-контрастное поле для больших микроскопов STANDARD UNIVERSAL, PHOTOMICROSCOPE и ULTRAPHOT II отличается от поля для микроскопов STANDARD серий WL, RA и KL, объясняется разным расстоянием интерференционно-контрастных полей от объективов (и другой оптики трубки).

Термины «главная призма» и «вторичная или компенсирующая призма» используются в связи с совершенно иным способом описания дифференциально-интерференционно-контрастного микроскопа (8, 26, 30, 32). В настоящей статье конструкция дифференциально-интерференционно-контрастного микроскопа Normaski в дидактических целях описывается как двухлучевой прибор. Вышеупомянутый второй подход является полезным дополнением и поэтому должен быть кратко рассмотрен: во-первых, представьте, что все оптические компоненты, такие как конденсор (со вторичной призмой), образец, объектив и главная призма между поляризатором и анализатором, удалены с пути распространения света. Поле зрения тогда будет полностью темным. Если теперь главную призму, то есть двупреломляющий компонент, вставить по диагонали между поляризатором и анализатором, поле будет частично освещено; будут видны интерференционные полосы, параллельные клиновидным граням призм компонентов; Полосы могут быть чёрными или цветными, в зависимости от того, используется ли для освещения монохроматический или полихроматический свет (только полоса или нулевая разность хода всегда будут чёрными). Если затем вставить вторичную призму в световой тракт вместе с оптикой, формирующей изображение, интерференционные полосы вторичной призмы можно заставить нейтрализовать полосы главной призмы в зрачке объектива, при условии, что обе призмы имеют соответствующие размеры и ориентацию: поле снова станет полностью тёмным. Это соответствует интерференционному контрасту, описанному выше в связи с интерференционным микроскопом, который существует при бесконечном расстоянии между полосами.

В то время как в системе проходящего света главная и вторичная призмы разделены, главная призма в системе отражённого света также действует как вторичная призма. Она входит в состав интерференционно-контрастного оборудования, в которое ввинчиваются соответствующие объективы отражённого света. Призмы адаптированы к числовой апертуре объективов. - Более подробную техническую информацию и практические советы см. в литературе, указанной на обороте (1, 2, 8, 24, 26, 29).

II. Формирование интерференционного изображения

Часть I общего описания дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии Normaski посвящена основам и экспериментальным конструкциям интерференционно-контрастного оборудования ZEISS (12). Вторая часть описания посвящена формированию дифференциально-интерференционно-контрастного изображения (далее именуемого ДИК-изображением, по предложению J. Gahm). Для этого в разделе 1 сначала будут описаны волновые фронты призмы Волластона. Фоновое изображение, зависящее от разности длины пути и амплитуды интерферирующих волн, обсуждается в разделе 2. Формирование ДИК-изображения (раздел 3) поясняется с помощью модельных объектов. Подробное обсуждение объектов из различных областей применения ДИК-микроскопии Normaski выходит за рамки данной серии статей и поэтому зарезервировано для отдельной публикации.

1. Волновые фронты в призме Волластона

Волновой фронт — это линия, соединяющая точки одинаковой фазы внутри волнового пакета (см., например, 1, 6, 11, 13, 14, 15, 23). Поведение волновых фронтов в призме Волластона (18) будет объяснено на примере a) рис. 1. В нижнем кристалле линейно поляризованная волна с плоским волновым фронтом Σ расщепляется на две плоскополяризованные компоненты, а именно, обыкновенную волну и необыкновенную волну. Обе волны имеют разные показатели преломления: в желтом натриевом свете с длиной волны 589,3 мкм обыкновенная волна в кристалле кварца имеет показатель преломления no = 1,5442, необыкновенная волна — neo = 1,5534. Следовательно, разница в показателе преломления составляет 0,0092, другими словами, neo почти на 0,6% больше, чем no. Поскольку скорость распространения волны в кристалле обратно пропорциональна показателю преломления, то обыкновенная волна имеет большую скорость, чем необыкновенная волна 1. В результате волновой фронт Σo опережает волновой фронт Σeo в нижней призме.

На склеенной поверхности происходит так называемое угловое расщепление волны, т.е. обыкновенная и необыкновенная волны движутся по разным траекториям. Угол между ними составляет менее половины минуты. Кроме того, обыкновенная волна нижней призмы становится необыкновенной волной в верхней призме, в то время как необыкновенная волна нижней призмы становится обыкновенной волной в верхней призме (12, 15, 21). В случае а) это означает, что в верхней призме волновой фронт Σeo опережает волновой фронт Σo, поскольку при Σo, Σeo опережает вторую волну в нижней призме настолько, что это опережение лишь медленно компенсируется в верхней призме. Поскольку угловое расщепление на склеенной поверхности очень мало, геометрические пути двух компонентов в центральном положении призмы Волластона, показанные на диаграмме, лишь немного больше, чем в нижней половине призмы. Следовательно, при выходе из призмы Волластона обе волны проходят одинаковые оптические пути 2, т.е. Оба волновых фронта выходят из призмы Волластона одновременно с нулевой разностью хода 2. Если после выхода из призмы Волластона обе волны проходят через воздух, то их показатели преломления одинаковы, т.е. их скорости одинаковы. В результате разность хода между двумя волнами сохраняется. В частном случае а) она равна нулю.

Если по причинам, которые будут рассмотрены ниже, требуется разность хода, её можно получить, сместив призму Волластона перпендикулярно направлению падающего светового пучка. В случае b) опережение Σo относительно Σeo в нижней призме таково, что оно компенсируется лишь частично в верхней половине призмы (волновые фронты не показаны): вне призмы Волластона Σeo опережает Σo. Противоположный случай показан в примере c).

При экспериментальной разработке оборудования ДИК для проходящего света с двумя призмами Волластона разность хода может быть получена путём смещения одной из них, поскольку для конечного ДИК-изображения не имеет значения, вызвана ли оптическая разность хода вспомогательной призмой в конденсоре или главной призмой (12, 16, 17, 18, 20), расположенной между объективом и изображением. Смещение главной призмы предпочтительно только из соображений удобства. Наиболее благоприятные условия для этого случая следуют из рис. 1, если диаграмму представить в перевёрнутом виде. — Если вместо призм Волластона использовать призмы Nomarski, то принципиально новых соображений относительно поведения волновых фронтов в кристалле (см. 7, 18) не возникло бы. Полученная таким образом диаграмма была бы лишь менее наглядна, чем в случае призм Волластона, рассмотренных выше.

2. Изображение интерференционного фона

Далее будут объяснены формирование и интерпретация фонового изображения в ДИК-микроскопии Nomarski. Под фоновым изображением мы понимаем изображение области образца, свободной от объекта. С помощью оборудования ДИК ZEISS (и использования белого света для освещения объекта) этот фон может выглядеть черно-белым, серым или цветным. Это означает, что может наблюдаться множество различных цветовых явлений, даже если на пути света нет микроскопического объекта. Эти явления не следует приписывать микроскопическому объекту, а рассматривать как характеристики прибора, как параметры оборудования 3. Подробное объяснение формирования фонового изображения, с одной стороны, демонстрирует множество возможностей оптического окрашивания. С другой стороны, оно призвано предостеречь от возможных источников ошибок при интерпретации интерференционного изображения из-за небрежного использования оборудования. - Прежде чем подробно остановиться на наиболее важных характеристиках этого оборудования, следует кратко рассмотреть несколько понятий из области интерференционных цветов.

1. Это правило справедливо для положительно одноосных кристаллов, таких как кварц. Обратное утверждение справедливо для отрицательно одноосных кристаллов, таких как кальцит (1, 21).

2. Длина оптического пути (2, 11, 13, 14, 15, 24): Δ = nd, где n = показатель преломления, d = геометрическая длина пути. Её также называют разностью хода Г, где Г' предпочтительно использовать для оптических разностей хода, например, Δ1 - Δ2.

3. В принципе, эти параметры оборудования применимы и к интерференционным микроскопам других конструкций, например, к интерференционно-контрастному оборудованию Jamin-Lebedeff фирмы ZEISS.

На рис. 2 схематически показаны условия в случае суперпозиции двух когерентных волновых пакетов белого света (11, 15, 22) с оптическими разностями хода Δ, равными 50, 200 и 550 мкм. Для большей ясности показаны только три цвета белого света, а именно синий (длина волны λ = 400 мкм), зеленый (λ = 550 мкм) и красный (λ = 700 мкм). С учетом знака интерферирующие компоненты (пунктирные и штриховые кривые) дают сплошные кривые в качестве результирующих волн. Если оптическая разность хода между и мала, например, 50 мкм, как показано в верхней части рисунка, то при других трех цветах конечные кривые имеют большие амплитуды, чем отдельные кривые: в этом случае мы говорим о конструктивной интерференции. Экстремум достигается, если Δ = 0 или кратно длине волны света. Таким образом, в нижней части рисунка оптическая разность хода 550 мкм эквивалентна длине волны зелёного света. В этом случае две компоненты находятся «в фазе», тогда как при Δ = 200 мкм две составляющие пучка синего света находятся в «противофазе». Они интерферируют деструктивно. Это означает, что белый свет лишается синей компоненты. Другие конечные кривые, в нашем примере зелёная и красная, затем равномерно смешиваются в соответствии с отношением их интенсивностей 4, образуя так называемый интерференционный цвет. (Во избежание недоразумений следует отметить, что этот интерференционный цвет не идентичен цвету на изображении, полученном с помощью дифференциально-интерференционного контраста ДИК).

Поскольку соотношение интенсивностей различных цветов меняется с оптической разностью хода, каждой разности хода соответствует характерный интерференционный цвет. Однако это относится только к разностям хода, не превышающим длину когерентности (см. 11).

На рис. 2 молчаливо предполагалось, что наложенные компоненты (пунктирные и штриховые кривые) колеблются в одной и той же плоскости. В интерференционных микроскопах это условие, необходимое для интерференции двух когерентных волн, не задано изначально, а должно быть реализовано с помощью анализатора. То же самое относится и к установке Nomarski ДИК: как видно из рис. 3а), анализатор, расположенный между главной призмой и окуляром (18), улавливает волны с векторами напряжённости электрического поля e1 и e2 и пропускает только компоненты e1А или е2А, совпадающие с направлением колебаний анализатора A (см. 1, 6, 7, 12). Однако компоненты е1Р или e2P, которые вместе дают ep, перпендикулярны направлению пропускания анализатора и, следовательно, не оказывают влияния на конечное ДИК-изображение. Кроме того, компоненты, параллельные направлению пропускания анализатора, показанные на рис. 3а), имеют противоположную, но одинаковую величину, так что они компенсируются. При переносе этих результатов на ДИК-оборудование ZEISS, рис. 3а) соответствует нулевой разности хода, т. е. поле зрения темное. Цветовая шкала Michel-Lévy (19) показывает, что нулевая разность хода эквивалентна черному цвету интерференции.

Если существует разность хода между двумя волнами, выходящими из главной призмы, то длины e1 и e2 различаются (рис. 3б). Следовательно, длины компонент e1A и e2A также различаются. На ДИК-изображении эффективным становится результирующий вектор этих двух векторов, а именно eA. (Вектор eP, полученный из e1P и e2P, перпендикулярен направлению пропускания анализатора и, следовательно, не вносит вклад в ДИК-изображение.) - Если разность хода составляет 50 мкм, например, как на рис. 2 вверху, ДИК-изображение примет оттенок между железным и лавандово-серым, что также очевидно из цветовой шкалы Michel-Lévy (6). Серо-синий или темно-красный оттенок на ДИК-изображении соответствует разности хода 200 или 500 мкм соответственно (см. рис. 2).

Если поляризатор и анализатор не перекрещены точно (рис. 3c и d), ДИК-изображение будет изменено по-разному. Хотя e1 и e2 имеют одинаковую длину на рис. 3c) (что соответствует нулевой разности хода), их компоненты в направлении пропускания анализатора, e1A и e2A, имеют различную величину. Следовательно, результирующий eA отличается от нуля (несмотря на нулевую разность хода). Он освещает фон изображения. Вектор eА, полученный из e1А и e2A, перпендикулярен A и, следовательно, не может повлиять на интерференционное изображение.

Если, кроме того, существует разность хода между компонентами 1 и 2, то e1, e2 и, следовательно, e1A, e2A также будут отличаться по длине (рис. 3d). Результирующий вектор eА падает на ДИК-изображение иначе, чем на рис. 3b). Чтобы избежать ненужных сложностей при интерпретации ДИК-изображения, рекомендуется работать со скрещенными поляризатором и анализатором.

3. Изображение DIC

В интерференционных микроскопах «структура объекта», видимая на микроскопическом изображении, является оптическим выражением весьма различных физических величин микроскопического объекта. С использованием оборудования Nomarski ДИК, описанного в данной статье, интерференционное изображение изотропного фазового объекта зависит а) от величины углового или бокового расщепления волны и б) от разности хода между двумя компонентами (см. также 6, 7, 11, 23). Разность хода, создаваемая прозрачным объектом, определяется произведением показателя преломления на геометрическую толщину объекта. Как показано в разделе 2, дополнительная разность хода может быть добавлена с помощью главной призмы.

Разность хода, создаваемая непрозрачным объектом, зависит от геометрического профиля объекта и фазовой задержки, возникающей при отражении волн от непрозрачного объекта. В этом случае также может быть введена дополнительная разность хода с помощью призмы Волластона (или Nomarski), которая в аппаратуре отраженного света проходит дважды и, следовательно, действует как вспомогательная, так и основная призма (12, 16, 17, 18, 20).

На рис. 4 слева показана схема блока ДИК для проходящего света с двумя призмами Волластона. Тело прямоугольного сечения представлено как изотропный, т.е. не двупреломляющий объект (предметное стекло, заливочная среда и покровное стекло не показаны). Состояние волновых фронтов в точках a–d на пути света показано в правой части рис. 4. Также обсуждается распределение интенсивности ДИК-изображения, сформированного в промежуточной плоскости изображения, обозначенной на схеме буквой e. Пусть показатель преломления объекта меньше показателя преломления заливочной среды: тогда части волновых фронтов, проходящие через объект, ускоряются, т.е. Они опережают части волнового фронта, не затронутые объектом. Результирующая деформация волнового фронта тем больше, чем больше толщина и меньше показатель преломления объекта.

В случаях от A до C разность хода предполагается равной + 1/2, а в случае D – + 1/8 (диаграммы c).

В случае A предполагается, что главная призма не вносит дополнительной разности хода между Σ1 и Σ2. Таким образом, функция главной призмы заключается в том, чтобы по существу компенсировать угловое расщепление волны, создаваемое вспомогательной призмой. При этом, однако, происходит боковое смещение деформаций волнового фронта (d), так что, в конечном счёте, вносятся разности хода между и Но возникающие таким образом разности хода могут возникать только в тех точках волновых фронтов, где объект уже внёс изменение разности хода Г на координату x. Для изображения ДИК важна только разность оптических путей между Σ1 и Σ2. С учётом знака, это получается путём вычитания волны Σ2 из Σ1 5. Результат показан на диаграмме d'. Если — следуя предложению Nomarski (16, 17, 18) — эта разность или дифференциальная волна ΣD предполагается невозмущенной опорной волной, дополненной второй плоской волной Σo, то представление в d' эквивалентно d. Однако оно значительно нагляднее, что особенно ощущается при сложных деформированных волновых фронтах.

Если используется монохроматический свет, для распределения интенсивности изображения ДИК справедливо упрощенное соотношение = lo sin^2 (Ф/2), где lo — максимальная интенсивность в изображении, а Ф — фазовый угол. Угол Ф = 360° соответствует разности хода Г = λ. Для Г = - 2/λ, соответствующей Ф = - 180°, sin (- 180°/2) = - sin 90° = - 1 и I = lo (-1)^2 = lo. То же самое значение получается для Г = + λ/2. При Г = 0, I также становится равным нулю. Таким образом, известны все значения, необходимые для отображения распределения интенсивности в направлении x на диаграмме e. Диаграмма e' дает представление о распределении интенсивности в направлениях x и y, поскольку на практике ДИК-изображение выглядит как круговой диск в промежуточной плоскости изображения. В данном примере на совершенно темном фоне видны две яркие полосы. Эти полосы указывают на то, что в соответствующей области образца оптическая толщина в направлениях x и/или y заметно отличается от таковой в непосредственно соседних точках.

Только это приводит к деформации первоначально плоских волновых фронтов, и на изображении ДИК становятся видимыми только те точки, в которых Г изменяется в направлении x (и/или y). В данном случае расстояние между полосами одновременно является мерой ширины фазового объекта. Ширина полос зависит от бокового смещения волны в оборудовании; она выбирается таким образом, чтобы быть меньше или, в лучшем случае, идентична разрешающей способности микроскопа. Кроме того, ширина полос зависит от изменения разности хода в направлениях x и y (от градиента Г) и, следовательно, от объекта или образца (см. примеры на рис. 5).

Изображение ДИК e' в случае B на рис. 4 показывает две чёрные полосы на ярком фоне. Следовательно, случай B является дополнительным к A. Инверсия распределения яркости вызвана разностью хода + λ/2 между Σ1 и Σ2 (диаграмма d). - В случае C (диаграмма d) Σ1 отстаёт от Σ2 на λ/2. Получается то же распределение интенсивности (e'), что и в случае B. При противоположном положении главной призмы, т.е. симметричном относительно нулевого положения, могут быть реализованы оба эти случая.

В случае D разность хода, создаваемая объектом, предполагается равной λ/8, а разность хода, создаваемая главной призмой, – λ/4 (d), в отличие от A, B и C. Вычисление распределения интенсивности показывает различную яркость двух полос. Создаётся впечатление одностороннего косого освещения объекта (7, 20) с хорошо известными трёхмерными эффектами 6. (См. также рис. 48, 81, 443 в работе Michel [14]).

На рис. 5 приведены дополнительные примеры формирования изображений DIC различных изотропных фазовых объектов. Здесь приведены только те диаграммы, которые необходимы для понимания проблемы. Пропущенные диаграммы легко можно добавить в соответствии с примером, показанным на рис. 4. Если вместо монохроматического света использовать белый свет, то контрастность объекта увеличивается за счет интерференционных цветов.

5. Это чисто формальное преобразование выполняется исключительно из соображений удобства и не имеет никакого отношения к вычитанию или сложению интерферирующих волн, необходимому в интерференционной микроскопии. До попадания в анализатор Σ1 и Σ2 не могут интерферировать по той простой причине, что направления их колебаний взаимно перпендикулярны.

6. Изображения фазового объекта, аналогичного обсуждаемой модели, полученные методом дифференциального контраста (ДИК), можно найти в другом месте (20). Следует отметить, что опубликованные там микрофотографии показывают две параллельные бороздки в испаренной пленке предметного стекла, так что в общей сложности можно увидеть четыре края; модельный объект на рис. 4, конечно же, может иметь только два края. Случай A в целом сопоставим с рис. 36a (в 20), случай C (и случай B) – с рис. 36c, а D соответствует рис. 36b.

Это будет объяснено с помощью волнового фронта (см. также [6]), который в аналогичной форме уже использовался на рис. 5 (I' d') для демонстрации процесса формирования изображения монохроматическим светом. Именно поэтому оптические длины волн и разности хода указаны на оси ординат в единицах, кратных половине длины волны используемого света. Это, конечно, неуместно в случае белого света.

В диапазоне «a» на рис. 6 Г составляет 300 мкм, что, согласно цветовой шкале Michel-Lévy (19), соответствует жёлтому цвету первого порядка. В диапазоне b Г увеличивается от 300 до 600 мкм, проходя через цвета от жёлтого первого порядка до синего второго порядка. Однако промежуточные интерференционные цвета выражены менее выражены, поскольку они относительно плотные из-за значительного изменения Г. То же самое относится и к другому концу диапазона b. Однако цвет плато (приблизительно индиго) может быть различим более чётко. В диапазоне c изменение Г с x не такое резкое, как раньше. Поэтому цвета легче распознаются, а именно, желтый и белый первого порядка на верхних краях борозд, за которыми следуют различные серые оттенки, которые наконец становятся черными при Г = 0.

Замечания по формированию изображения ДИК в проходящем свете справедливы и для отраженного света. Характерные различия существуют только в двух моментах. Во-первых, одна призма Волластона или Nomarski представляет собой вспомогательную и главную призмы в оборудовании для отраженного света. Однако такую компоновку можно формально преобразовать в установку для проходящего света, как было объяснено в другом месте (12). Во-вторых, существует существенное различие в причинах деформации волновых фронтов объектом. В случае изотропных прозрачных объектов локальное произведение показателя преломления и геометрической толщины объекта определяет форму и степень деформации волнового фронта. В случае непрозрачных объектов рельеф поверхности и, следовательно, геометрический путь, а также запаздывание фазы, вызванное отражением волны от объекта (21), определяют форму и величину деформации волнового фронта (6, 11, 23). Это иллюстрируется рис. 7. Пусть непрозрачный объект состоит из двух фаз (заштрихованных), которые придают отраженным волнам различную величину запаздывания. Плоский волновой фронт, отраженный объектом, преобразуется в волновой фронт Σ1. Прямоугольные деформации могут одновременно служить примером формирования неоднозначного изображения (см. также рис. 4, B, C; другие примеры см. в публикациях 6, 11, 18, 23). Подобные особые случаи в принципе возможны, если конечное изображение является, помимо прочего, результатом действия двух различных величин, таких как толщина и показатель преломления объекта. В таком случае однозначная интерпретация возможна только на основе дополнительной информации или измерений с использованием одной из этих двух величин.

III. Сравнение с фазовым контрастом

В части I общего описания объясняются основы и экспериментальная установка для дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии (ДИК) по Nomarski (11). В части II рассматривается формирование ДИК-изображения (12). В настоящей части III сравниваются характеристики оборудования для ДИК и фазово-контрастной микроскопии (ФК). Это сравнение ограничено приборами, работающими в проходящем свете. Сравнение с оборудованием, работающим в отражённом свете, будет опубликовано отдельно. В заключительном разделе, части IV, обсуждается применение ДИК-микроскопии по Nomarski.

1. Экспериментальная установка

Подавляющее большинство биологических образцов представляют собой так называемые фазовые объекты. Чисто фазовые объекты (в отличие от амплитудных) не влияют на амплитуду волн, излучаемых объектом. Помимо дифракции света на деталях объекта, фазовые объекты изменяют разность хода между волнами, проходящими через поле объекта, и волнами, проходящими через окружающее поле. Однако человеческий глаз, выступающий в роли детектора при визуальном наблюдении микроскопического светлопольного изображения, не способен распознать эту разность хода. Чтобы сделать её видимой, необходимо соответствующим образом модифицировать световой путь.

Световой путь микроскопов ZEISS проходящего света и светлопольного микроскопа может быть изменён пользователем благодаря наличию соответствующих аксессуаров. (То же самое относится и к микроскопам ZEISS отражённого света.) Чтобы переоборудовать микроскоп светлопольного микроскопа для фазово-контрастного наблюдения (рис. 1), необходимо заменить конденсорную ирисовую диафрагму на кольцевую диафрагму и установить в выходном зрачке объектива фазовую пластинку, оптически сопряжённую с конденсорным кольцом. Поскольку зрачок объективов микроскопов, прежде всего светосильных и мощных, находится внутри оптической системы, для фазовой работы изготавливаются специальные фазово-контрастные объективы, в которых, по предложению Michel, фазовая пластинка находится в слое цемента между линзами. (История развития метода фазового контраста обсуждается в [9, 10]).

Чтобы переоборудовать микроскоп светлого поля для интерференционной микроскопии (рис. 1), достаточно добавить поляризатор и призму Nomarski под передней фокальной плоскостью конденсора, а также вторую призму Nomarski и второй поляризатор (в качестве анализатора) над объективом (см. 17).

2. Характеристики оборудования ZEISS ФК и ДИК

Подробное обсуждение различий между фазово-контрастными и интерференционно-контрастными аксессуарами выходит за рамки данной серии статей. Поэтому нижеследующие пояснения будут ограничены описанием некоторых характерных особенностей этих двух методов оптического окрашивания.

2.1. Азимутальный эффект

Специфические компоненты, необходимые для фазового контраста, являются вращательно-симметричными. В результате фазово-контрастное изображение фазового объекта не зависит от угловой, т.е. азимутальной, ориентации объекта относительно фазово-контрастной системы. В отличие от этого, система Nomarski ДИК не вращательно-симметрична, но имеет выраженное выделенное направление (1, 8, 23). Это направление задается конструкцией призмы Nomarski и ее фиксированной угловой ориентацией относительно поляризатора и анализатора. Из-за асимметрии призмы Nomarski относительно оптической оси микроскопа, эффект ДИК возникает в направлении краёв призмы, но не перпендикулярно им, поскольку дифференциальное замедление волн эффективно только в направлении краёв призмы (1, 11, 12, 19, 20, 21). Эффект этого явления проиллюстрирован на рис. 2.

Однако этот недостаток оборудования DIC редко оказывается мешающим. Он особенно ярко проявляется в линейных фазовых объектах, вытянутых в направлении сдвига.

При использовании поворотного столика образца линейный объект всегда можно сориентировать таким образом, чтобы интересующая деталь отображалась с оптимальным дифференциально-интерференционным контрастом. Нелинейные объекты практически не демонстрируют этот азимутальный эффект (см. рис. 4–7).

2.2. Эффект гало

Гало на изображении краев объектов типичны для фазового контраста. В позитивном фазовом контрасте 1 край объекта с более высоким показателем преломления, чем его окружение, имеет светлую окантовку снаружи и тёмную внутри (эффект гало). Противоположная ситуация наблюдается, когда объект с более низким показателем преломления, чем его окружение, рассматривается в позитивном фазовом контрасте. Здесь следует кратко упомянуть причины возникновения гало 2. Объекты с выраженной фазовой природой распознаются в микроскопе светлого поля лишь с трудом, если вообще распознаются, поскольку они практически не ослабляют падающий на них свет. Однако небольшая часть падающего излучения отклоняется от своего первоначального направления; она дифрагирует на фазовом объекте. По сравнению с недифрагированным светом, дифрагированные лучи сдвинуты по фазе на 90°.

1. Все фазово-контрастные насадки ZEISS разработаны для положительного фазового контраста. В результате объекты, оптическая толщина которых превышает оптическую толщину окружающего поля, выглядят тёмными на ярком фоне.
2. Ссылки см., например, в 2, 4, 5, 6, 7, 13, 14, 15, 16, 22, 26.

В фазовом контрасте Zernike (28, 29)

а) прямой свет также сдвигается по фазе на 90°;

б) интенсивность прямого света уменьшается до уровня, сравнимого с интенсивностью дифрагированного света;

в) дифрагированный свет и прямой свет с уменьшенной интенсивностью и сдвинутой фазой накладываются друг на друга для интерференции.

Фазово-контрастное оборудование ZEISS удовлетворяет всем этим условиям благодаря поглощающей кольцевой фазовой пластине в передней фокальной плоскости объектива.

Фазовая пластина ускоряет свет на 90° (положительный фазовый контраст). Чтобы максимально уменьшить влияние фазовой пластины на прямой свет, для освещения используется полый световой конус, создаваемый кольцевой конденсорной диафрагмой. Несмотря на эту меру предосторожности, определенная часть дифрагированного света также проходит через фазовую пластину, поскольку при прохождении излучения через образец каждая точка фазового объекта становится волновым центром, от которого дифрагированный свет отклоняется в определенных направлениях. Чем мельче детали объекта, тем больше угол дифракции. Если фазовый объект имеет значительную протяжённость и дифференцированную структуру (что практически всегда имеет место в случае биологических объектов), дифрагированный свет также пройдёт через фазовую пластинку (заштрихованный луч на рис. 3 [см. 24]). Этому свету придаётся дополнительная разность хода 90° (нежелательная, но неизбежная). Он конструктивно интерферирует с прямым светом в промежуточной плоскости изображения, т.е. его интенсивность увеличивается (яркая полоса). С одной стороны, интенсивность и степень эффекта гало определяются параметрами оборудования, определяемыми степенью поглощения и фазового сдвига недифрагированного света фазовой пластинкой. С другой стороны, эффект гало зависит от размера объекта (23), явление, которое будет более подробно рассмотрено в следующем параграфе. Кроме того, эффект гало также зависит от разницы в показателях преломления между объектом и окружающим его полем (8, 23), как видно из рис. 7.

В целом, эффект гало, таким образом, частично обусловлен состоянием оборудования. Хотя его можно в некоторой степени уменьшить за счет подходящей конструкции фазово-контрастных принадлежностей, полностью устранить его невозможно.

Одностороннее высветление краев объекта, подобное эффекту гало, иногда наблюдается и в дифференциально-интерференционном контрасте. Однако это явление обусловлено совершенно другими причинами, которые были объяснены в части II в связи с описанием формирования изображения методом дифференциально-интерференционного контраста (12).

3. Рисунки 4 и 7 предоставлены профессором доктором P. Stoll и доктором. H. Gundlach.

2.3. Размер объекта и разница показателей преломления

Существует прямая связь между эффектом гало в фазово-контрастной микроскопии и ограниченным диапазоном размеров объектов, подходящих для оптимального воспроизведения в фазово-контрастном микроскопе (1, 7, 23). По причинам, указанным в пункте 2.2, фазовая структура фазовых объектов «среднего» размера не воспроизводится с высокой точностью, поскольку фазовая пластина Ph-объектива оказывает нежелательное влияние на дифрагируемый ими свет. Какой размер объекта на практике следует считать «средним», зависит, с одной стороны, от размера кольцевой конденсорной диафрагмы (с сопряженной фазовой пластиной), а с другой — от увеличения используемой фазово-контрастной системы. Например, фазовый объект, обнаруживающий эффект гало при наблюдении с фазовыми насадками типа Ph-2, следует считать «средним». Если тот же объект исследовать с фазово-контрастным объективом большей мощности (Ph-3 с соответствующим кольцевым конденсорным диаметром), он может быть признан большим. Таким образом, вполне возможно, что один и тот же объект может демонстрировать ореолы при среднем увеличении, но не иметь ореолов при большом увеличении.

Однако следует отметить, что одного лишь размера объекта (для данной фазово-контрастной системы) недостаточно для объяснения эффекта гало. Другим фактором, который следует учитывать, является разница в показателях преломления объекта и среды. Чем больше эта разница, тем сильнее выражен эффект гало (8, 14). Поэтому вполне возможно, что не только объекты среднего размера, но и, например, малые объекты демонстрируют выраженный эффект гало (см. рис. 7). Адаптируя показатель преломления среды к показателю преломления объекта, можно значительно уменьшить эти гало.

В отличие от фазовой работы, ДИК-микроскопия не характеризуется столь выраженной зависимостью качества изображения от размера фазовых объектов. ДИК-микроскопия может быть одинаково успешно применена к малым, средним и крупным микроскопическим объектам без ухудшения качества изображения (1, 7, 23). Однако это относится только к интерференционным микроскопам, использующим принцип дифференциального сдвига, т.е. в которых боковое смещение волновых фронтов (12) меньше или эквивалентно разрешению микроскопа (7). В случае интерференционных микроскопов, основанных на полном расщеплении, например, интерференционной насадки проходящего света ZEISS Jamin-Lebedeff, допустимый размер объекта должен быть меньше расстояния между измерительным и опорным пучками (11), чтобы получить удовлетворительные результаты. Ещё одно преимущество ДИК-микроскопии по Nomarski является приятным дополнением к ФК-микроскопии: выраженные различия в показателях преломления объекта и заливочной среды, приводящие к появлению искажающих ореолов на фазово-контрастном изображении, весьма желательны для работы с ДИК. Они обеспечивают превосходное контрастное изображение и позволяют различать мельчайшие детали (например, рис. 7, нижняя часть изображения), которые в фазово-контрастном изображении скрыты яркими ореолами вокруг объекта.

2.4. Оптическая толщина объекта

Разница между оптической толщиной (произведением показателя преломления и геометрической длины пути) объектного поля и окружающего поля определяет оптическую разность пути Г между объектной волной и полевой волной. Фазовый угол φ в градусах может быть вычислен, как известно, из соотношения φ = Г 360°/λ, где λ - длина волны используемого монохроматического света. Пусть выражение K = (Emax - Emin)/Emax будет контрастом, где Emax и Emin - максимальная и минимальная интенсивность излучения, соответственно, микроскопического изображения. Построив график зависимости контраста от фазового угла, мы получаем информацию об оптимальном диапазоне, в котором следует использовать микроскопическую технику. Согласно Michel (14, стр. 110), фазовая пластина с 64% поглощением, вносящая фазовый сдвиг на 90°, теоретически увеличит контраст от 0 до 0,9, если фазовый угол увеличится от 0 до 20°. Для очень малых фазовых углов контраст будет даже линейно изменяться с φ. Этот диапазон наиболее чувствителен к изменениям фазового угла. Максимальный контраст достигается между 30° и 35°. Выше этих значений K падает до 0 при 180° с увеличением φ. При фазовых углах от 180° до 360° (отрицательный фазовый контраст) кривая инвертируется. Диаграмма также показывает, что даже при разнице хода до половины длины волны (φ = 180°) могут формироваться неоднозначные фазовые изображения, поскольку сильно различающиеся фазовые углы имеют одинаковую степень контраста (25). Так, например, контраст 0,4 соответствует фазовым углам как 5°, так и 130°. На практике это означает, что при указанных условиях точки с разной оптической толщиной в фазовом объекте невозможно различить, поскольку они имеют абсолютно одинаковый фазовый контраст. Поэтому для обеспечения однозначных и точных результатов метод фазового контраста предпочтительно использовать для фазовых объектов с малыми фазовыми углами, не превышающими 30°, что эквивалентно разнице хода не более λ/12. По мнению Michel (14, с. 119), разность толщин в 1/100 мкм (= 10 нм = 100 Å) всё ещё может быть различима при контрасте 0,3 в фазовом объекте с показателем преломления 1,5; если геометрическая толщина фазового объекта составляет 5 мкм, в объекте может быть обнаружена разность показателей преломления 0,001. Приведённое выше объяснение показывает, что толстые образцы непригодны для исследования методом фазового контраста (14, с. 120). То же самое относится и к образцам с клиновидной текстурой: в обоих случаях точное воспроизведение кольцевой конденсорной диафрагмы на фазовой пластинке объектива микроскопа затруднено, если не невозможно (рис. 5). В этих неблагоприятных условиях фазовый контраст теряет свою экспериментальную основу и всё больше превращается в метод светлого поля со всеми недостатками, присущими воспроизведению фазовых объектов.

По возможности, тонкие объекты следует использовать и для ДИК-микроскопии. В случае очень толстых объектов, которые, к тому же, не лежат ровно на предметном стекле (рис. 5), интерференционная плоскость вспомогательной призмы конденсора не может быть точно сфокусирована на сопряженной интерференционной плоскости главной призмы над объективом. Для сравнения, на рис. 6 показан тонкий плоский фазовый образец. В этом случае изображение зрачка фазово-контрастного микроскопа также показывает резко очерченную кольцевую конденсорную диафрагму и фазовую пластинку объектива; в ДИК-микроскопе резко очерченное изображение апертурной (ирисовой) диафрагмы конденсора также видно в плоскости зрачка.

Сравнение микрофотографий, опубликованных в этом журнале (27), может служить примером различного качества изображения, получаемого при фазово-контрастной и дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии. Это сравнение также показывает, что метод ДИК может быть использован в гораздо большем диапазоне разностей хода лучей в объекте, чем это было бы практически возможно при фазово-контрастном методе. Если в этой связи рассмотреть диаграмму цветности Michel-Lévy, то становится очевидной чёткая маркировка фазового объекта интерференционными цветами в широком диапазоне разностей хода. Небольшие разности хода, порядка 50 нм (т.е. примерно 110 длин волн зелёного света), попадают в область серого цвета первого порядка. Серый тон изменяется очень медленно с увеличением разности хода (например, до 100 нм). Неопытные наблюдатели распознают эти изменения лишь с трудом. Однако в области красного цвета первого порядка даже незначительные изменения разности хода примерно на 10–20 нм (что эквивалентно 2–4% длины волны зелёного света) приводят к достаточно заметным изменениям цвета, которые могут быть обнаружены даже неопытными наблюдателями. Поскольку система Nomarski ДИК позволяет смещать одну из призм Nomarski таким образом, чтобы фон изображения в определённых пределах мог быть перпендикулярен оси микроскопа (см. 11, 12), фазовые объекты всегда могут быть воспроизведены с оптимальным контрастом.

Если бы для оценки пригодности метода ДИК для определения оптической толщины использовалась только диаграмма цветности Michel-Lévy, могло бы сложиться впечатление, что ДИК-микроскопия подходит только для относительно больших разностей хода (например, 40 нм и более). Однако это не так. Опыт показал, что даже очень малые разности хода могут быть визуализированы. Рис. 2 может служить примером. Исключительные возможности ДИК-микроскопии, вероятно, обусловлены тем, что при благоприятных условиях 4 фазовые объекты могут быть воспроизведены с контрастом 1. Благодаря такому широкому диапазону контрастов наблюдатель может обнаружить незначительные различия в яркости и, следовательно, различия в оптической толщине.

4. Под благоприятными условиями здесь понимается, например, однофазный объект с относительно небольшим количеством структурных деталей на однородном, т. е. бестекстурном фоне.

2.5. Градиент оптической толщины

Существенное различие между ДИК - и фазово-контрастной микроскопией обусловлено латеральным изменением оптической толщины фазового объекта; в этом случае мы также говорим о влиянии градиента оптической толщины на вид ДИК-изображения (1, 8). Для лучшего понимания следует напомнить, что ДИК-микроскопию можно рассматривать как двухлучевую интерференционную микроскопию с дифференциальным сдвигом (7, 11). Если обе волны проходят одинаковые оптические пути, они будут создавать одинаковую интенсивность на ДИК-изображении; в частном случае, когда призмы Nomarski находятся в центральном положении (нулевая разность хода) со скрещенными поляризатором и анализатором, интенсивность на ДИК-изображении будет равна нулю. Другими словами, изменение интенсивности (в вышеупомянутом случае – осветление ДИК-изображения) возможно только в том случае, если две волны проходят разные оптические пути. Однако, поскольку эти две волны разделены лишь малым расстоянием – расстоянием, примерно эквивалентным разрешению микроскопа, – изменение интенсивности может происходить только при существенном изменении оптической толщины объекта даже на таком коротком расстоянии. Или можно сказать, что частный дифференциальный коэффициент оптического пути в фазовом объекте, относящийся к боковому сдвигу в системе ДИК, должен отличаться от нуля, чтобы выявить фазовую структуру объекта на ДИК-изображении. (Известно, что для метода фазового контраста такого требования не существует [см. 8].) Естественно, это требование легче выполнить на краях объектов, чем на протяженных фазовых объектах. Поэтому вполне возможно, что на ДИК-изображении будут видны только границы фазового объекта. Это было пояснено на нескольких примерах при обсуждении формирования ДИК-изображения (12, рис. 4, случай A, и рис. 5, фрагмент I). Однако было обнаружено, что даже метод фазового контраста не полностью свободен от этой сложности в отношении интерпретации изображения. На изображении, полученном с помощью дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), обширного фазового объекта однородной оптической толщины распределение интенсивности внутри фазового контрастного объекта приближается к распределению интенсивности в окружающем поле с увеличением его размера. В крайнем случае объект будет выделяться на фоне только из-за эффекта гало (26), и следует отметить, что граница между светлой и тёмной полосами не обязательно совпадает с фактическими границами фазовой структуры (см. 25).

С точки зрения высокоточного воспроизведения фазовых структур вышеупомянутая особенность дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии может показаться недостатком. Однако именно этот очевидный недостаток весьма полезен при исследовании микроскопических объектов с сильно варьирующейся фазовой структурой, поскольку мелкие фазовые детали, которые на изображении фазового контраста остаются незамеченными или различимы с трудом, иногда выделяются с исключительной чёткостью на изображении, полученном с помощью ДИК (см. рис. 7, внизу). Это связано с тем, что на ДИК-изображении распределение интенсивности определяется разницей в длине пути между (плоской) опорной волной и (деформированной) дифференциальной волной (12). Это объясняет, почему даже в случае сильно структурированных объектных полей с сильно варьирующейся оптической толщиной фон будет выглядеть достаточно плоским («плоским»). Локальные разности оптических путей рельефно выделяются на этой «плоскости».

2.6. Глубина резкости

Существенное преимущество ДИК-микроскопии по Nomarski перед фазово-контрастной микроскопией заключается в малой глубине резкости, обеспечиваемой этим методом. Известно, что в фазово-контрастной системе осветительная (и визуализирующая) апертура определяется размерами фазово-контрастной насадки и не может быть изменена. В ДИК-микроскопии по Nomarski, напротив, диаметр апертурной диафрагмы конденсора легко адаптируется к требованиям образца (1), как и при работе в светлом поле. Относительно большая апертура (примерно апертура объектива) обычно может использоваться без потери контраста. Благодаря этой большой осветительной апертуре метод ДИК обеспечивает лишь малую глубину резкости, что особенно важно для толстых объектов. Таким образом, детали вне фокальной плоскости меньше искажают микроскопическое изображение, чем при фазово-контрастной микроскопии (см. рис. 2). В результате ДИК-изображения превосходного качества могут быть получены даже в неблагоприятных условиях, когда фазово-контрастные изображения, ввиду большой глубины резкости, делают идентификацию фазовых структур невозможной из-за перекрытия деталей над и под исследуемыми объектами, а также из-за эффекта гало. В этом случае примером может служить нижняя часть рис. 7 (см. также 23).

2.7. Дихроичные объекты

Одним из источников ошибок в методе ДИК является необходимость использования поляризованного света. Мы можем различать обыкновенный и необыкновенный лучи, как было описано в предыдущих частях данной статьи (11, 12). В так называемых дихроичных объектах обыкновенный и необыкновенный лучи поглощаются в разной степени. Другими словами, они интерферируют с разной интенсивностью, так что изображение, полученное методом ДИК, является функцией не только разности оптических путей двух лучей, что обычно представляет интерес, но и разного поглощения в двух пучках. Этот эффект сравним с установкой, в которой плоскости пропускания поляризатора и анализатора не идеально перпендикулярны друг другу (см. 12). Фазовый контраст, с другой стороны, не требует использования поляризованного света. Следовательно, метод ФК свободен от возможных помех, вызванных дихроичными веществами. В целом, можно сказать, что на практике лишь изредка возникает необходимость исследовать дихроичные (т.е. поглощающие) объекты с помощью микроскопов, предназначенных для фазовой съемки.

3. Резюме

Помимо выдающихся особенностей принадлежностей ZEISS DIC, описанных в этой серии статей, посвященных ДИК-микроскопии по Nomarski, существует ряд аспектов, которые здесь не обсуждаются. Помимо этих теоретических соображений, практический опыт также не позволяет классифицировать метод ДИК по Nomarski на данном этапе, поскольку, как было установлено, ДИК-микроскопия по Nomarski все чаще применяется в областях, где традиционные методы световой микроскопии неэффективны или дают лишь неудовлетворительные результаты.

Однако мы уже точно знаем, что ДИК-микроскопия по Nomarski прочно заняла свои позиции в микроскопии отраженного света, поскольку во многих случаях она явно превосходит фазово-контрастную микроскопию падающего света. В проходящем же свете, напротив, эти два метода, как и прежде, дополняют друг друга. Это ещё раз подтверждает концепцию ZEISS, сочетающую кольцевые диафрагмы для фазово-контрастной микроскопии со вспомогательными призмами Nomarski для ДИК-микроскопии в ахроматическом-апланатическом конденсоре типа V.

Следует также отметить, что фазово-контрастные и ДИК-насадки ZEISS отличаются одним существенным моментом: фазово-контрастные системы ZEISS оснащены фазовыми пластинами для обеспечения постоянного фазового сдвига и постоянного поглощения. Системы ДИК ZEISS Nomarski позволяют изменять как фазу света, так и его амплитуду (первая — путём регулировки одной из призм Nomarski, вторая — путём смещения анализатора из скрещённого положения относительно поляризатора). Если, несмотря на это, метод фазового контраста практически не утратил своего значения, это, вероятно, обусловлено двумя причинами:

а) методы фазового контраста используются в основном для исследования биологических и медицинских объектов, и

б) биологические и медицинские фазовые объекты, как правило, настолько сильно различаются по локальной оптической толщине, что было бы неразумно и невозможно получить оптимальный контраст в каждой точке всего фазового объекта с помощью системы переменного фазового контраста (см. 14, стр. 117). Таким образом, в этих случаях компромиссное решение будет неизбежным.

Однако в микроскопии отраженного света ситуация, по-видимому, совершенно иная. Здесь исследуемые микроскопические объекты изначально являются «плоскими», и их рельеф изменяется лишь в относительно узких пределах. (В случае прозрачных объектов этот рельеф эквивалентен геометрической толщине.) Второй переменной является локально различающееся фазовое запаздывание при отражении падающего света от поверхности непрозрачного объекта. (В случае прозрачных объектов вместо этого необходимо учитывать показатель преломления.) В отличие от прозрачных объектов, интересная деталь в непрозрачных объектах часто представляет собой небольшой фазовый объект на однородном фазовом фоне. В этом случае чрезвычайно полезной особенностью системы Nomarski ДИК является тот факт, что, подбирая соответствующую разность хода с одной из призм Nomarski, можно добиться оптимального выделения объекта на фоне окружающей среды с помощью интерференции (см. 8). Однако в случае биологических объектов диапазон, в котором возможно использование окрашивания по разнице хода, значительно уже и ограничен долями длины волны (обычно ниже λ/4). Именно поэтому в случае (биологических) прозрачных образцов потребность в микроскопическом методе, позволяющем варьировать интенсивность окрашивания, гораздо менее актуальна, чем в случае (небиологических) непрозрачных объектов.

Продолжение

https://vk.com/@microhobbi-carl-zeiss-dik-po-nomarski-prodolzhenie