Иммерсия в микроскопии
Иммерсия— это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения. Одним из способов увеличения оптической разрешающей способности микроскопа является использование иммерсионных жидкостей между передней линзой объектива и покровным стеклом. Большинство объективов с увеличением от 60x до 100x (и выше) предназначены для использования с иммерсионным маслом. Хорошие результаты были получены с маслом, имеющим показатель преломления n = 1,518, что близко к показателю преломления стекла. Таким образом устраняются все отражения на пути от объекта к объективу. Если бы этот трюк не использовался, отражение всегда вызывало бы потерю света в покровном стекле или на передней линзе в случае больших углов (см. рис 2).
Одним из наиболее важных факторов, определяющих разрешающую способность объектива, является угловая апертура, которая имеет практический верхний предел около 72 градусов (при синусоидальном значении 0,95). В сочетании с показателем преломления продукт:
n(sin(θ))
Известна как числовая апертура (сокращенно NA ) и обеспечивает удобный индикатор разрешения для любого конкретного объектива. Числовая апертура обычно является наиболее важным конструктивным критерием (помимо увеличения), который следует учитывать при выборе объектива микроскопа. Значения варьируются от 0,025 для объективов с очень малым увеличением (от 1x до 4x) до 1,6 для объективов с высокими характеристиками, использующих специальные иммерсионные масла. По мере увеличения значений числовой апертуры для ряда объективов с одинаковым увеличением мы обычно наблюдаем большую светосилу и увеличение разрешения.
Числовая апертура объектива может быть значительно увеличена путем разработки объектива для использования с иммерсионной средой, такой как масло, глицерин или вода. При использовании иммерсионной среды с показателем преломления, подобным показателю покровного стекла, ухудшение изображения из-за изменений толщины покровного стекла практически устраняется, благодаря чему лучи с большим углом наклона больше не преломляются и легче захватываются объективом. Типичные иммерсионные масла имеют показатель преломления 1,51 и дисперсию, аналогичную дисперсии покровных стекол. Поэтому световые лучи, проходя через препарат, сталкиваются с однородной средой между покровным стеклом и иммерсионным маслом и преломляются не при входе в линзу, а только при выходе из ее верхней поверхности.
Общая конструкция практического масляного иммерсионного объектива включает в себя полусферическую переднюю линзу, за которой следует линза с положительным мениском и группа дуплетных линз. На рис. 1 представлены апланатические рефракции, возникающие на первых двух линзах типичного апохроматического масляного иммерсионного объектива. Образец помещают между предметным стеклом и покровным стеклом в точке Р , апланатической точке полусферического элемента линзы. Лучи света, преломляясь в задней части полусферической линзы, как бы исходят из точки P(1), который также является центром кривизны первой поверхности менисковой линзы. Преломленные световые лучи входят в менисковую линзу по радиусу ее первой поверхности и не преломляются на этой поверхности. На задней поверхности мениска линзы световые лучи преломляются апланатически, поэтому они кажутся расходящимися от точки Р(2) . Преломление световых лучей на поверхностях последующих групп линз в объективе завершает схождение световых лучей, исходящих из точки Р , формируя промежуточное изображение.
Правильно спроектированные объективы с масляной иммерсией также корректируют хроматические дефекты, вносимые первыми двумя линзами, при этом внося минимальную сферическую аберрацию. Тот факт, что световой конус частично сходится перед входом в первый элемент линзы, помогает контролировать сферическую аберрацию. Следует отметить, что использование масляного иммерсионного объектива без нанесения масла между покровным стеклом и первым элементом линзы приводит к дефектным изображениям. Это происходит из-за рефракции, возникающей на поверхности передней линзы, которая вносит сферическую аберрацию, которую нельзя исправить с помощью последующих компонентов линз внутри объектива.
Преимущества масляных иммерсионных объективов резко снижаются, если используется неподходящая иммерсионная жидкость. Производители микроскопов выпускают объективы с жесткими допусками по показателю преломления и дисперсии, что требует согласования значений в жидкости, помещенной между покровным стеклом и передней линзой объектива. Рекомендуется использовать только масло, предназначенное производителем объектива, и не смешивать иммерсионные масла разных производителей, чтобы избежать неприятных артефактов, таких как кристаллизация или разделение фаз.
Объективы, в которых в качестве среды визуализации используется вода и/или глицерин, также доступны для применения с живыми клетками в культуре или срезами ткани, погруженными в физиологический раствор. Планапохроматические водоиммерсионные объективы оснащены корректирующими кольцами и числовой апертурой до 1,2, что немного меньше, чем у их масляно-иммерсионных аналогов. Эти объективы позволяют микроскопистам фокусироваться в водной среде размером до 200 микрон и при этом сохранять превосходную оптическую коррекцию. Недостатком является то, что иммерсионные линзы с высокой числовой апертурой часто стоят многие тысячи долларов, а изображение все еще может ухудшаться, когда объектив глубоко сфокусирован через преломляющие ткани или части клеток.
Дополнительные преимущества
-Возникающие на поверхностях покровного стекла и фронтальной линзе объектива паразитные отражения существенно меньше, нежели у «сухих» объективов, а в некоторых случаях паразитные рефлексы могут быть полностью устранены. Это улучшает контраст изображения и позволяет поднять освещённость препарата без вредного влияния на изображение.
-Толщина слоя жидкости между объективом и препаратом может меняться, и за счёт этого можно в некоторых пределах изменять компенсацию сферической аберрации
Применяются:
- Кедровое или минеральное масло (показатель преломления 1,515)
- Водный раствор глицерина (1,434)
- Силиконовое масло (1,406)
- Физиологический раствор (1,3346)
- Дистиллированная Вода (1,3329)
- Монобромнафталин (1,656)
- Вазелиновое масло (1,503)
- Йодистый метилен (1,741)
Водный раствор глицерина
Глицерин — применение в качестве иммерсионной жидкости нашёл благодаря пропусканию ультрафиолетового диапазона электромагнитных волн. Используется в виде водного раствора определённой концентрации. Первый объектив глицериновой иммерсии был рассчитан в 1867 году.
Вода
Используется дистиллированная вода. Считается, что впервые в серийный микроскоп рассчитанный объектив водной иммерсии был введён в 1850 году.
Силикон
3D-визуализация живых клеток может быть сложной задачей по ряду причин, таких как низкое отношение сигнал/шум, снижение жизнеспособности клеток и фотообесцвечивание флуорофоров. Решающую роль выбора правильного иммерсионного масла часто упускают из виду.
Японские ученые проанализировали, как силиконовые иммерсионные объективы со значительным улучшением сферической аберрации по сравнению с традиционными линзами идеально подходят для различных приложений трехмерной визуализации и визуализации живых клеток в областях биологии развития и регенеративной биологии, нейробиологии, микробиологии и многих других областях.
Эти яркие флуоресцентные изображения были получены с использованием обоих наборов объективов. XY-изображения, полученные с силиконовыми иммерсионными объективами на глубине 35 мкм, были ярче с более высоким разрешением. Уменьшенное несоответствие показателя преломления силиконового иммерсионного объектива обеспечивает отличные результаты при исследовании глубоких тканей на образцах, сделанных прозрачными.
Отношение к иммерсии
- объективы сухой иммерсии;
- объективы с иммерсией (указывается тип иммерсии): ВИ, WI - водная иммерсия; МИ, HI, Oil - масляная иммерсия; Glyc - глицериновая иммерсия; Sil - силиконовая иммерсия.
Иммерсионные масла
Типы:
Тип А- используется в качестве иммерсионной жидкости при работе с апохроматическими и ахроматическими объективами микроскопов всех видов, кроме люминесцентных, в видимой области спектра. Предназначено, в первую очередь, для работы с отечественными микроскопами, не оснащенными системой визуализации изображения. Соответствует требованиям ГОСТ 13739-78 “Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний”.
Тип Б- предназначен, в первую очередь, для микроскопов с искусственным освещением, оснащенных системой визуализации изображения.
В сравнении с классическим маслом, иммерсионное масло типа Б обладает меньшей вязкостью, что позволяет использовать его в автоматических и полуавтоматических системах, и более высоким светопропусканием.
Тип С- такие оптические характеристики масла как показатель преломления, температурный коэффициент показателя преломления и средняя дисперсия не должны заметно отличаться от аналогичных характеристик материала линзы микроскопа. Величина коэффициента пропускания влияет на количество проходящего света и освещенность препарата. В связи с тем, что люминесценция зачастую возбуждается ультрафиолетовыми лучами (300-400 нм), к коэффициенту пропусканию для нефлюоресцирующего иммерсионного масла в области 400-350 нм предъявляются особые требования: коэффициент пропускания должен быть не менее 70%.
Тип N - аналогичен типу Б
Тип F - нефлюоресцирующие масло
Силиконовое масло - применяется для силиконовых объективов
Источники
https://www.youtube.com/watch?v=DDCSM7wA3KQ
https://www.agat.ru/new/?ELEMENT_ID=9122
https://www.agat.ru/new/?ELEMENT_ID=5100
https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/oilimmersionrefractiveindex/indexflash.html