Освещение по Рейнбергу

Mortimer Abramowitz и Michael W. Davidson

Освещение по Рейнбергу - один из видов оптического окрашивания, который был впервые продемонстрирован британским микроскопистом Джулиусом Рейнбергом Королевскому микроскопическому обществу и Квекетт-клубу (Англия) более ста лет назад. Эта техника представляет собой яркую вариацию освещения темного поля малой и средней мощности с использованием цветных желатиновых или стеклянных фильтров для придания насыщенного цвета как образцу, так и фону.

Технику Рейнберга можно сравнить с более привычным освещением в темном поле. В темнопольной микроскопии подстроечный конденсор расположен таким образом, что лучи света от лампы, проходящие через конденсор, проходят через образец только под очень косым углом. Центральная часть светового конуса, проходящего через конденсор, закрывается непрозрачной заглушкой, достаточно большого диаметра, чтобы свет не попадал непосредственно в объектив микроскопа. В более сложных конденсорах темного поля - параболоидных, кардиоидных, Кассегрена или Лейхтбильда - закрытие прямого света и использование только косых лучей достигается за счет использования специально разработанных зеркальных поверхностей.

При освещении в темном поле числовая апертура объектива выбирается (или уменьшается с помощью объективной диафрагмы или ограничителя воронки) таким образом, чтобы свет от конденсора не попадал непосредственно в объектив. Единственный свет, который попадает в объектив, - это свет, отраженный, преломленный или дифрагированный образцом, когда косые лучи от конденсора «ударяют» по образцу. В этом случае образец выглядит ярким на черном поле; отсюда и название «темнопольное освещение». Резкий контраст яркого объекта на черном поле увеличивает видимость уже разрешенных деталей. Конденсор темного поля можно приблизить (к иллюстрации на рис. 1), когда зеленый центральный фильтр заменяется непрозрачным, а красный фильтр косого освещения удаляется, позволяя пропускать нефильтрованный белый свет.

При освещении по Рейнбергу (см. рис. 1), которое относится к темному полю, используется несколько видов и форм фильтров. Косые или внешние лучи света, проходящие через широко открытый конденсор яркого поля, проходят через кольцевой (в форме пончика) фильтр одного или нескольких цветов (красный фильтр на рис. 1 и кольцевые фильтры на рис. 2); центральные лучи света проходят через другой точечный фильтр, вставляемый в круглое отверстие кольцевого фильтра, как показано для нескольких комбинаций на рис. 2. Объектив используется на полной апертуре. В этом конкретном случае образец будет выглядеть либо красным на зеленом фоне (рис. 2(a)), либо желтым на синем фоне (рис. 2(b)), либо зеленым на красном фоне (рис. 2(c)).

Фильтры Рейнберга изготавливаются в виде прозрачных кольцевых цветных колец с круглым отверстием в центре, как показано на рисунке 3. В коммерческих версиях этих фильтров прилагается набор прозрачных цветных пятен или «центральных фильтров», которые плотно прилегают к отверстиям кольцевых колец (рис. 4). Диаметр центрального фильтра можно изменять (для регулирования интенсивности фонового освещения) путем увеличения размера узких черных колец, отделяющих фильтр от внешнего кольца (рис. 4(a-c)). Эффективные комбинации: красное кольцо, фиолетовый центральный фильтр; желто-оранжевое кольцо, синий центральный фильтр и т. д. Другие визуально эффектные изображения получаются при использовании прозрачного бесцветного кольца с цветным центральным фильтром. Например, прозрачное кольцо с красным центральным фильтром позволит получить белое или бесцветное изображение на красном фоне.

В результате внешнее кольцо «становится» цветом образца, а центральный фильтр - цветом фона. Внешнее кольцо также может быть разделено на чередующиеся цветовые сектора, как показано на рис. 5. Секторные фильтры особенно эффективны при изучении тканей с начесом, граней кристаллов, диатомей и срезов древесины, где размеры по длине и ширине отображаются контрастными цветами.

В течение многих лет некоторые производители микроскопов продавали фильтры Рейнберга из цветного геля (похожие на фильтры Кодака Раттена), которые предварительно вырезались для установки в кольцевые фильтры микроскопов. Кольцевые кольца имели внешний диаметр 31-35 миллиметров, а центральные фильтры обычно имели диаметр 15-18 миллиметров для использования с объективом 10x - 0,25 NA. Эти фильтры также можно легко изготовить в лаборатории, используя фильтры Кодака-Раттена или цветные фильтры, которые широко доступны в научных магазинах и у дистрибьюторов оптических компонентов. Желатиновые фильтры можно подготовить, вырезав центральный фильтр пробковым бором соответствующего диаметра, а кольцевые кольца можно подготовить, аккуратно нарисовав круг на фильтровальной бумаге и вырезав его ножницами. В нашей лаборатории специалисты по механической обработке изготовили латунный штамп, который вырезает кольцевые круги для фильтров того же диаметра, что и наш держатель фильтров Рейнберга. Этот штамп позволяет быстро штамповать очень ровные круги из листов ацетатных или желатиновых цветных фильтров. Центр кольцевого фильтра можно вырезать тем же бором, который используется для подготовки центрального фильтра.

Иногда бывает трудно создать прочный корпус для центрального фильтра внутри кольцевого фильтра, если оба они сделаны из очень тонких ацетатных или желатиновых фильтров. В этом случае вы можете просто приклеить центральный фильтр к центру кольцевого фильтра с помощью двустороннего скотча, но помните, что цвета центрального и кольцевого фильтров будут складываться, поэтому используйте очень темный фильтр для центрального фильтра. Центральный фильтр, как правило, должен быть намного темнее кольцевого, чтобы блики на образце резко контрастировали с фоном. Мы часто помещаем два или три центральных фильтра одного цвета в стопку, чтобы регулировать пропускание света через центральный фильтр. Фильтры Рейнберга можно изготовить и из стеклянных фильтров, что очень удобно, если подстроечный конденсор оснащен корпусом для этих фильтров. В этом случае лучше всего просто приклеить центральный фильтр к центру стеклянного фильтра. Для тех, кто заинтересован в изготовлении собственных фильтров, более полное описание представлено в книге Needham's Practical Use of the Microscope.

Мы сравнили методы освещения в светлом, темном поле и по Рейнбергу с помощью микрофотографий клеща оленя (Ixodes dammini), представленных на рисунке 6. Первая микрофотография (а) иллюстрирует клеща при освещении в светлом поле. Изображению не хватает контраста, и многие детали трудно различимы. На рисунке 6 (b) тот же клещ показан при освещении в темном поле, где контрастность и детализация изображения выше, а многие особенности клеща хорошо видны. Освещение по Рейнбергу (рис. 6(c)) с использованием синего центрального фильтра и желтого кольцевого фильтра (см. рис. 2(b)) вызывает эффект повышенной контрастности, аналогичный темнопольному, но с приятным синим фоном. В данном примере методы освещения в темном поле и по Рейнбергу дают значительно лучшие микрофотографии, чем в светлом поле.

В конце 1930-х годов компания Carl Zeiss выпустила специальный конденсор Mikropolychromar, предназначенный для получения прекрасных изображений Рейнберга. Этот конденсор давно снят с производства и сейчас практически недоступен, но он состоял из апланатического конденсора, под которым находились три отдельно управляемые диафрагмы. Крайняя диафрагма регулировала диаметр поля, а две диафрагмы меньшего размера контролировали прохождение света через центральный диск. В комплект входили кольцевые прозрачные кольца различных цветов. К ним прилагался набор прозрачных стеклянных центральных дисков, которые аккуратно вставлялись в центральное отверстие кольцевого кольца. Этот оригинальный конденсор был использован одним из авторов (М. Абрамовиц) для получения поразительных микрофотографий при различных увеличениях, некоторые из которых были опубликованы в изданиях Omni, Time-Life, Scientific American и National Wildlife.

Освещение по Рейнбергу подходит для объективов от 2x до 100x. Однако для того, чтобы четко разделить внутренний и внешний цвета, вокруг центрального фильтра следует поместить непрозрачные металлические или бумажные кольца. Например, непрозрачные кольца могут иметь внешний диаметр 15-18 миллиметров для 10-кратного объектива, а для 60-кратного объектива с масляной иммерсией лучше всего подойдет внешний диаметр 22 миллиметра. Чтобы добиться наилучших результатов при освещении по Рейнбергу, стоит поэкспериментировать с центральными фильтрами, подобными тем, что показаны на рисунке 4.

Для изучения волокон, простейших, текстиля, насекомых, срезов древесины, хрусталя и других неокрашенных малоконтрастных объектов микроскопистам стоит добавить в свою библиотеку методов контрастирования освещение по Рейнбергу. Это позволит просматривать и фотографировать образцы, получая изображения, которые визуально улучшаются, а также эстетически красивы.

И последнее замечание от авторов: Мы настоятельно рекомендуем производителям микроскопов и/или независимым производителям аксессуаров выпускать конденсоры и фильтры Рейнберга для использования микроскопистами. Необходимые компоненты будут стоить очень недорого и значительно помогут микроскопистам в настройке их микроскопов для освещения по Рейнбергу.