Создание постоянных растительных препаратов

Jörg Weiß

Введение

Под постоянным растительным образцом обычно понимается окрашенный участок образца растительного материала, который был сохранен на предметном стекле путем погружения покровного стекла в смолу и может оставаться неповрежденным в течение десятилетий. Обработанный таким образом срез должен показывать клетки растения в их естественной форме и в естественной структуре ткани, поэтому препарат не должен максимально изменять ткань. Допускаются два исключения: мы должны делать тонкие срезы, чтобы иметь возможность просматривать образцы под микроскопом в проходящем свете, и специфического окрашивания различных типов клеток таким образом, чтобы их было легко распознать и различить.
Чтобы достичь этого, необходима тщательная работа на всех этапах от взятия проб до резки и фиксации, окрашивания и окончательного заключения. И, конечно же, есть полезные приемы для каждого шага, которые вы можете найти здесь. Шаги в деталях:

Отбор проб

При отборе проб необходимо в первую очередь отметить, охраняются ли рассматриваемые растения и не должны ли они быть собраны или повреждены в природе. Тогда есть вопрос собственности: конечно, надо спросить, прежде чем вытаскивать нож в бордюре или в ботаническом саду. Между прочим, ботанические сады наших университетов являются очень хорошими источниками редких растений и дают возможность получить определенные экземпляры с уверенностью. Если вы хорошо попросите здесь, вам редко откажут и часто вы получите дополнительную поддержку.
Желаемые части растения следует выбирать так, чтобы растение было как можно меньше повреждено. Это легко сделать с листьями, но найти побег или даже корень, который можно удалить, не причиняя слишком большого ущерба и не нарушая имиджа растения в саду для следующего посетителя, зачастую совсем не тривиально. Часто обходиться без единственное решение, если только садовник не знает, что делать, и, например, не указывает, что необходимо провести обрезку.
Сама проба должна быть взята острым ножом, чтобы излишне не травмировать как пробу, так и растение. Здесь неплохо справится скальпель со свежим сменным лезвием или резак из строительного магазина. Ножниц следует избегать, так как они слишком сильно сдавливают образец и, в зависимости от желаемого направления разрезания, даже делают его непригодным для использования.
Дальнейшая обработка образца теперь должна происходить как можно быстрее. Если от вашего собственного сада до рабочего стола всего несколько метров: не проблема. Но что, если, как у картонного саговника, показанного выше, впереди еще более долгое путешествие? Здесь у нас в основном есть два варианта: фиксация по частям позволяет транспортировать образец в течение более длительного периода времени без того, чтобы он пришел в негодность. Однако необходимо иметь при себе необходимую химию (вспомните проверки безопасности в аэропортах. «Это AFE» — недостаточное объяснение), и вы лишены возможности сфотографировать свежие срезы с их естественными цветами (хлорофилл ).
Второй вариант – транспортировать тестовые образцы в плотно закрывающемся пластиковом пакете (есть даже застежка-молния!), в который помещается смоченный минеральной водой кусок кухонной бумаги. Затем хорошо выдавите воздух перед запечатыванием, чтобы замкнутый объем был как можно меньше. Подготовленный таким образом образец выдерживает длительное путешествие невредимым. От 24 до 48 часов не проблема, но также может быть обеспечена поездка домой продолжительностью от 1 до 2 часов, чтобы образцы оставались как можно более свежими.

Срез

Наш образец, благополучно доставленный на рабочее место, необходимо разрезать, чтобы получить небольшую толщину, необходимую для микроскопии в проходящем свете, и чтобы можно было распознать расположение клеток. Срез от руки лезвием бритвы требует наименьших усилий, но также требует наибольшей практики. Здесь можно получить секции толщиной от 50 до 100 мм, но секции обычно расклиниваются и поэтому менее подходят для «хорошей» постоянной подготовки.
Небольшие микротомы, такие как микротом с ручным цилиндром или микротом с коробкой Хага, являются хорошим компромиссом, каждый из которых имеет свои подводные камни. В зависимости от материала достигаемая здесь толщина резки составляет от 20 до 70 мм и, следовательно, находится в оптимальном диапазоне для обрезки растений.
Салазки и ротационные микротомы находятся на верхнем уровне технической сложности. Работа с этими горами металла также должна быть хорошо отработана и иногда сопряжена с риском (бесплатный нож с предметным микротомом).
Важно хорошо подготовить образец: побеги и корни, как правило, можно срезать отдельно, толщиной около 3 мм, листья обычно приходится поддерживать. Лучше всего для этого подойдет свежая нарезанная морковь. И нож, и образец должны быть влажными. Так как вода имеет слишком высокое поверхностное натяжение, этанол является первым выбором. Если вы хотите потом сфотографировать свежий срез, концентрация не должна превышать 30% (возможно также использовать бычью желчь - Fel Tauri - из запасов маляра). В остальном для увлажнения зарекомендовал себя 70% этанол. Здесь вполне достаточно денатурата из аптеки.
Затем срезы удаляют тонкой щеткой (размер 000) и помещают непосредственно в AFE для фиксации. В качестве альтернативы, конечно, фотосъемке с аква дестом. помещают на предметное стекло (не забудьте покровное стекло).

Цветы и бутоны, в частности, просто распадутся, если их срезать отдельно или в моркови. Здесь предпочтительным методом является заливка в парафин или ПЭГ.

Фиксация

Целью фиксации является уничтожение бактерий, которые всегда присутствуют, и прекращение ферментативной активности, чтобы разрез оставался точно таким же, как у нас. В случае растительных материалов это лучше всего делать с помощью известного фиксирующего раствора AFE. AFE состоит из 90 мл 70% этанола на 100 мл (подойдет денатурированный этанол), 5 мл 36% формальдегида и 5 мл 99% уксусной кислоты.
Этанол убивает бактерии и обесцвечивает содержимое клеток, формальдегид денатурирует белки и таким образом останавливает обмен веществ в клетках. Так как этанол удаляет воду из клеток и, таким образом, сжимает их, также присутствует некоторое количество уксусной кислоты, которая заставляет клеточные стенки снова набухать и, таким образом, сохраняет естественный эффект разреза в соответствии с требованиями.
При необходимости также достаточно фиксации в 70% этаноле.
Если секции закреплены, как описано здесь, они должны оставаться в AFE не менее 20 минут. Пребывание в течение нескольких часов не наносит вреда и приводит к более четким цветам за счет лучшей фиксации при последующем окрашивании.
Фиксацию и все дальнейшие действия лучше проводить в часовом стекле диаметром примерно 6-8 см. В часовом стекле удобно обрабатывать до 50 срезов, добавляя и отсасывая соответствующие реагенты с помощью пипетки. Если в банке много надрезов, время от времени встряхивайте ее, чтобы реагенты работали равномерно.
Если необходимо зафиксировать целые кусочки образца, они должны быть доступны в виде подходящих кусочков длиной не более 2 см (побег, черешок и корень) или площадью около 1 см² (листья) и оставаться в AFE не менее 2 дней.

Дальнейшая подготовка к окрашиванию

Для достижения особенно чистого окрашивания, фиксированные участки можно дополнительно обрабатывать в два этапа. Прежде всего, однако, они должны быть перегнаны шаг за шагом через уровни спирта 70%, 50% 30% и в дистиллированной воде. Это в значительной степени предотвращает «танцевание» разрезов при добавлении воды, которое может повредить хрупкие материалы.
Теперь его сначала обрабатывают Eau de Javel примерно от 1 до максимум 3 минут. Это необходимо делать под увеличительным стеклом, так как слишком длительное время экспозиции растворяет клеточную структуру и тем самым разрушает срезы. Eau de Javel можно легко заменить раствором Klorix, разбавленным в пропорции 1:4 (синяя бутылка!). Eau de Javel представляет собой водный раствор гипохлорита калия (KClO), обычно в смеси с хлоридом калия (KCl), и довольно агрессивно разрушает содержимое клеток, оставляя только клеточные стенки и, возможно, некоторые устойчивые клеточные тела. Также безопасно удаляются различные смолы и выделения. Klorix содержит гипохлорит натрия в сочетании с хлоридом натрия и делает то же самое. Участки срезов, особенно содержащие лигнин, могут сначала немного потемнеть, но есть выход.
Во-первых, проводят многократное полоскание с помощью aqua dest. Как описано выше, срезы остаются в часовом стекле, Eau de Javel или Klorix отсасываются как можно лучше пипеткой, а затем aqua dest. Сначала в быстрой последовательности, затем дайте ему подействовать еще немного, пока не исчезнет запах хлора. Для этого нюхаем часовое стекло, которое держим прямо под носом (пожалуйста, только ближе к концу процесса...).
Следующий этап – отбеливание хлоралгидратом. Нам понадобится раствор 250 г хлоралгидрата в 100 мл дистиллированной воды. К сожалению, это недешевое удовольствие и хлоралгидрат не так просто получить в больших количествах в качестве снотворного. Счастлив тот, кто знает фармацевта, непредубежденного в приобретении химикатов для микроскопии.
Осадки остаются в растворе хлоралгидрата от 8 до 24 часов, а затем, как и в случае с Eau de Javel, очень хорошо промываются дистиллированной водой. После этого они полностью обесцвечиваются и представляют собой наилучшую отправную точку для получения четкой и красочной окраски.

Раскраска

Теперь цвет вступает в игру! Существует достаточно большое количество микроскопических красителей, удовлетворяющих указанному выше условию хороших перманентных препаратов и специфически окрашивающих разные типы клеток. В дополнение к цветовому эффекту также важно прилагаемое усилие: при некоторых окрашиваниях разные красители должны работать один за другим, что в каждом случае требует этапа полоскания (последовательное окрашивание), при одновременном окрашивании применяется цветовая смесь, которая , после определенного времени экспозиции, делает всю работу за один прием.
Цветовые эффекты также зависят от толщины среза и в значительной степени от исходного материала и подготовки. Однако часто бывает так, что большие усилия, затраченные на многократное окрашивание, вознаграждаются более дифференцированным цветовым эффектом. Самым известным множественным окрашиванием, безусловно, является W3A Робина Вакера, наиболее известным одновременным окрашиванием, вероятно, является Etzold FCA. Но есть много других рецептов окрашивания.
В простейшем случае одновременный цветной раствор должен действовать около 7 минут, а затем смывается водой и промывают до тех пор, пока на срезах не перестанут появляться цветные облака, а промывочная вода не станет прозрачной.
В случае, если цвет был непреднамеренно перекрашен, дифференциацию можно провести с помощью спирта соляной кислоты или просто 70% этанола до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое цветовое впечатление. Дифференцировку останавливают добавлением дистиллированной воды и тщательной промывкой несколько раз. Действуйте осторожно, иначе красные краски будут слишком бледными. Мягкий метод заключается в том, чтобы оставить срезы в воде на несколько часов, пока не будет достигнут желаемый эффект.

Монтаж

Теперь срезы можно поместить в воду на предметном стекле и просмотреть или сфотографировать, но без защитного чехла мы не будем ими долго наслаждаться. Мы находим такую защитную оболочку в виде различных смол. Многие до сих пор знают канадский бальзам или малинол. Обе смолы требуют промежуточной стадии с ксилолом, веществом, которое не совсем безвредно и труднодоступно в настоящее время. Поэтому Euparal зарекомендовал себя как монтажная смола для ботанических секций, которые можно легко покрыть изопропанолом.
К сожалению, Euparal тоже достать непросто, так как частным лицам производитель не поставляет. Однако в большинстве случаев в микроскопической ассоциации есть коллега, который может помочь с закупками.

Если работа с различными смолами слишком обременительна для вас, вы также найдете на рынке монтажные материалы на водной основе, но я не могу здесь делать никаких заявлений о долговременной стабильности.
Например, чтобы иметь возможность покрыть Euparal, наши секции должны быть сначала осушены. Делается это чистым изопропанолом (не ниже 99,9%, продается в литровых бутылках за небольшие деньги в аптеках). Для слива, последняя промывочная вода как можно лучше отсасывается, а затем добавляется не слишком мало изопропанола. Так как все смеси спирта и воды обладают дифференцирующим эффектом и, в частности, извлекают красные красители, содержание воды должно быть быстро уменьшено, поэтому изопропанол необходимо отсасывать 3 раза в быстрой последовательности, а затем снова добавлять свежий.
Изопропанол быстро испаряется и во время процедуры срезы не должны пересыхать, иначе будут образовываться пузырьки воздуха, которые трудно удалить. Поэтому добавляйте изопропанол сразу после уборки пылесосом!
Теперь дайте свежему изопропанолу подействовать дважды в течение примерно 1 минуты и, наконец, 3 раза в течение примерно 5 минут. Теперь мы можем предположить, что любой остаточной влагой, которая все еще может присутствовать в срезах, можно пренебречь.
Предметные и покровные стекла должны быть чистыми для заключения. Их можно очистить, например, 70% этанолом. Осторожно, разбить покровное стекло в пальце очень неприятно...
Сухой тонкой кистью (опять же размером 000) делаем участок изопропанола на предметном стекле и капаем на него одну-две капли Euparal. Будьте осторожны, изопропанол и здесь не должен испаряться, но время для выравнивания среза еще есть. Разрешается промакивание изопропанолом, но и здесь слишком много вредно, иначе Euparal слишком сильно сожмется, и пузырьки воздуха позже будут затягиваться под покровное стекло.

Для нанесения смолы есть специальные бутылочки из матового стекла со стеклянной палочкой, но подойдет и зубочистка. Что касается количества, вы должны практиковаться и набираться опыта. Они зависят от размера капли и диаметра стеклянной палочки, а толщина и размер среза и покровного стекла определяют необходимое количество смолы.
Покровное стекло теперь можно разместить с помощью двух пинцетов. Для этого придерживайте его с одной стороны плоским пинцетом и кладите с другой стороны под углом к слегка открытым кончикам заостренных пинцетов, а затем медленно и спокойно опускайте, что позволяет избежать включения пузырьков воздуха. Здесь пригодится шаблон предметного стекла (вы можете скачать его здесь ), а также потребуется немного практики.
Несколько слов о покровных стеклах: круглые покровные стекла (например, диаметром 18 мм) не имеют уголков, под которыми впоследствии могут образовываться пузырьки воздуха...
Теперь образец проверяется под микроскопом, а затем помещается в нагревательную плитку для просушки и с помощью гайки размера 8, кладут на покровное. После высыхания смолы (около 7 дней желательно на плите или на обогревателе) просто нужно пометить.
Можно использовать самоклеящиеся этикетки подходящего размера, например, или распечатать этикетки и наклеить. На этикетках должна быть как минимум следующая информация: общепринятое и научное название образца, часть растения, толщина среза, окраска и дата создания. Фиксатор и покрывающая смола также могут быть включены. Если у вас много препаратов, номер и знак качества могут иметь смысл, а довершает дело имя создателя.