Что общего между биологией и лучевой терапией?

HSO talks

Автор: Зоя Шамитько

Фактчекер: Елизавета Чуйкова, Олеся Игина

Редактор: Мария Орлова

Администратор: Елизавета Лукашова

Верстальщик: Рита Гилева

В предыдущей части мы уже познакомились с различными видами ионизирующего излучения, с их природой и отличиями. Пришло время узнать, что происходит при взаимодействии радиации с живыми клетками…

Механизмы радиационного повреждения

Проходя через вещество, излучение выбивает электроны из атомов, нарушая их электронную оболочку. В результате образуются положительно заряженные ионы, т.е. свободные радикалы. Этот процесс называется ионизацией, и его сущность одинакова вне зависимости от того, что именно мы облучаем: бетонную стену или живую ткань.

Но, как вы могли заметить, строение клетки гораздо более сложное и хрупкое, чем у бетонной стены. В неживом объекте ионизация может привести лишь к структурным дефектам, а вот в несчастной клетке радиация запускает целый биохимический каскад: образовавшиеся свободные радикалы немедленно вступают в реакции с другими молекулами, нарушая их структуру и функции. И если поврежденный белок или липид может быть быстро утилизирован и заменен другим, то молекула ДНК существует в клетке в единственном экземпляре и является основой для синтеза всех клеточных структур. Её повреждение чревато потерей функции генов, нарушением деления — и гибелью клетки. Поэтому основной мишенью лучевой терапии является именно ДНК опухолевых клеток.

Радиационное повреждение ДНК может происходить по двум механизмам: прямому и непрямому. При прямом взаимодействии частица или фотон бьют прямо по молекуле ДНК, вызывая разрывы химических связей. Но в клетке, состоящей на 70-80% из воды, гораздо чаще реализуется второй механизм — непрямой. Излучение взаимодействует с молекулами воды, вызывая их радиолиз и порождая огромное количество свободных радикалов. Они попадают в клеточное ядро и взаимодействуют с ДНК. Именно непрямое действие ответственно за большую часть повреждений ДНК.

Есть интересная зависимость между линейной передачей энергии (linear energy transfer, LET) и типом повреждений ДНК (если вас испугал термин LET, то лучше прочесть первую часть статьи). Чем выше LET, тем больше доля прямых повреждений. Когда я узнала про это правило, то единственным вопросом, который возник у меня в голове, был: «Почему?»

На самом деле, тут нет каких-то сложных формул, объяснение предельно простое. Излучение с высокой LET (например, альфа-излучение) имеет очень высокую плотностью ионизации. Это означает, что на очень коротком отрезке своего пути такая частица создает огромное количество ионизированных атомов. Из-за этого резко возрастает вероятность того, что сама молекула ДНК окажется непосредственно на траектории частицы и получит прямое попадание. И наоборот, излучение с низкой LET (например, рентгеновские лучи) производит редкие и разрозненные акты ионизации по всему объему клетки. Вероятность прямого попадания в ДНК в этом случае совсем небольшая.

Радиочувствительные и радиорезистентные фазы клеточного цикла

Казалось бы, всё просто: облучили опухоль, повредили ДНК — и цель достигнута. Но в действительности этот процесс гораздо сложнее. Создать необратимые, летальные повреждения в ДНК — непростая задача, ведь клетка обладает мощной системой репарации, способной эффективно чинить разрывы и исправлять ошибки. Поэтому в радиобиологии принято выделять несколько типов повреждений ДНК в зависимости от их последствий для клетки.

Летальные повреждения — это необратимые и нерепарируемые нарушения, которые неизбежно ведут к гибели клетки.

Сублетальные повреждения — не приводят к гибели клетки сразу, но создают кумулятивную угрозу. Клетка выживает только в том случае, если ей удается полностью устранить все повреждения до того, как их совокупность станет несовместимой с жизненно важными функциями.

Потенциально летальные повреждения — реализуются как летальные, если клетка вступает в митоз с неисправленной ДНК. Но если деление по каким-либо причинам откладывается, например, из-за недостатка ростовых факторов или неблагоприятных условий, то у системы репарации появляется дополнительное время, чтобы устранить повреждения и сохранить клетку жизнеспособной.

Для запуска процесса репарации клетка должна приостановить клеточный цикл. Для этого в клеточном цикле есть три временных промежутка, так называемые контрольные точки, в которых клетка может «затормозиться» при повреждении ДНК. Это граница между G1 и S-фазой, промежуток во время S-фазы и на границе между G2 и М-фазой.

Как мы выяснили, остановить клеточный цикл с целью репарации можно не в любой момент, а в строго определённых чекпоинтах. Из-за этого возникают радиочувствительные и радиорезистентные фазы цикла.

Понять этот феномен можно, разобрав два примера.

Ситуация-1:

Если ДНК получила значительные повреждения ДО прохождения контрольной точки, то во время её прохождения клеточный цикл останавливается. Происходит репарация – и клетка опять продолжает делиться, живёт долго и счастливо.

Ситуация-2:

Если ДНК получила повреждения ПОСЛЕ прохождения чекпоинта, то регуляторы клеточного цикла уже никак не смогут помочь: клетка войдет в митоз без репарации и погибнет.

Таким образом, к чувствительным фазам цикла относятся фазы M и G2, а к резистентным – G1 и S.

Что может повлиять на эффективность лучевой терапии?

Почему одни опухоли отвечают на лучевую терапию лучше, а другие хуже? Давайте посмотрим на этот вопрос с точки зрения радиобиологии и разберёмся, от чего в принципе может зависеть эффективность облучения.

1. Фаза клеточного цикла

Как нетрудно предположить, выживаемость клеток напрямую определяется фазой клеточного цикла в момент облучения. На графике чётко видно, насколько различаются последствия для клеток, захваченных радиацией в радиочувствительной и радиорезистентной фазах.

Кстати, такой график называется кривой выживаемости. По вертикальной оси – доля выживших клеток, сохранивших способность к делению после облучения. Чем круче кривая спадает вниз, тем выше радиочувствительность ткани и тем выше эффективность лучевого воздействия.

Как видно из графика, на спад идут все кривые, но для каких-то это снижение резкое, а для каких-то – более плавное. О чём это говорит? О том, что термин “резистентная фаза цикла” означает не абсолютную резистентность, а относительную. Не существует фазы клеточного цикла, обеспечивающей полную защиту от радиации. Клетки в резистентной фазе тоже гибнут, но для достижения того же уровня клеточной гибели, что и в чувствительных фазах, требуется значительно большая доза ионизирующего излучения.

2. Доза ионизирующего излучения

Кстати, про дозу. От неё тоже зависит доля выживших клеток. Чем большая доза подается на опухоль, тем меньше оставшихся в живых клеток.

Казалось бы, правило простое, на этом можно было бы остановиться. Но в медицине не бывает “просто так”, у любой закономерности есть своя причина. И вновь возникает вопрос: «Почему?»

Дело в том, что при увеличении дозы ионизирующего излучения статистика работает против клетки. Радиация бьёт случайно, и чем больше «выстрелов», тем выше вероятность, что ДНК получит какие-то повреждения, в том числе летальные. Даже если клетке повезло и она не получила летальные повреждения, происходит перегрузка системы репарации, которая оказывается не в состоянии справиться с огромным количеством накопившихся сублетальных повреждений, что вызывает гибель клетки.

3. Линейная передача энергии (LET)

Если эффективность лучевой терапии зависит от дозы, то может ли она зависеть от вида радиации? Будет ли разница в биологическом эффекте, если подавать на ткань одну и ту же дозу, но разными типами излучения? Ответ – да!

Дело в том, что прямое действие радиации обычно приводит к летальным повреждениям, в то время как непрямое — чаще вызывает сублетальные повреждения. Но, как мы обсуждали выше, существует чёткая зависимость: чем выше LET, тем больше доля прямых повреждений. Логическим продолжением этого правила является вывод: чем выше LET, тем выше доля летальных повреждений.

А теперь посмотрим на кривые выживаемости…

Для излучений с низким LET (например, для рентгеновских лучей) кривая имеет выраженное плечо в области малых доз, из-за него кривая более плавная. Это период накопления сублетальных повреждений, которые в одиночку не вызывают гибель клетки. Массовая гибель начинается лишь при достижении дозы, достаточной для того, чтобы количество повреждений превысило репаративный потенциал.

А вот для излучений с высоким LET кривая выживаемости не имеет начального плеча и сразу резко обрывается вниз. Это означает, что даже минимальные дозы оказывают выраженный летальный эффект. Такой характер кривой объясняется высокой вероятностью прямых попаданий, вызывающих гибель клетки “на месте” без необходимости в накоплении повреждений.

Кстати, из-за такого разного биологического эффекта у различных типов излучения была даже введена особая единица измерения радиации.

Обычно для измерения радиации используются термин абсорбируемая доза, которая измеряется в Греях.

А вот когда речь идет о живых объектах и об оценке радиационного риска, то используется эквивалентная доза, которая измеряется в Зивертах. Эквивалентная доза – это абсорбируемая доза, умноженная на коэффициент, который указывает на опасность данного типа излучения для живых тканей. Коэффициент зависит от LET.

Подушнили с единицами измерения – и хватит. Возвращаемся к облучению опухолей. От чего же ещё зависит эффективность лучевой терапии?

4. Оксигенация

На этом этапе можно начинать рубрику «забавные радиобиологические эксперименты прошлого»...

В начале прошлого столетия один немецкий ученый, прикладывая аппликатор с радием к своему предплечью, заметил, что кожная реакция уменьшается, если аппликатор с силой придавливать к коже. Не до конца понимая суть явления, он всё же сделал верный вывод: дело в том, что, надавливая аппликатором на кожу, он пережимал капилляры и тем самым нарушал локальное кровообращение.

Затем был проведен целый ряд экспериментов, в которых исследовалось влияние радиации на живые ткани в условиях недостатка кислорода. В качестве подопытных выступали семена овощей, корни фасоли, различные опухоли и даже яйца аскарид. Вывод всегда был один: по каким-то причинам кислород усиливает губительный эффект ионизирующего излучения.

Это явление назвали кислородным эффектом. Его суть заключается в способности кислорода усиливать повреждающее действие радиации на ДНК при непрямом механизме воздействия.

Как мы уже знаем, при непрямом действии основную роль играют свободные радикалы, которые образуются при радиолизе воды. Эти высокоактивные частицы способны атаковать различные клеточные структуры, включая молекулу ДНК, при этом они образуют радикалы ДНК. Но в клетке существует система защиты: такие повреждения могут быть восстановлены при взаимодействии с тиольными группами (R-SH), например, в составе глутатиона.

Радиосенсибилизирующий эффект кислорода заключается в нарушении этого защитного механизма. Он с высокой скоростью вступает в реакцию с радикалами ДНК, конкурируя с тиольными группами. В результате образуется пероксидный радикал ДНК — стабильное и уже необратимое повреждение, которое впоследствии приводит к разрывам цепей ДНК.

Силу кислородного эффекта можно измерить. Для этого был придуман так называемый oxygen enhancement ratio (OER). По сути, это соотношение доз, необходимых для достижения одинакового биологического эффекта в условиях гипоксии и нормоксии.

Разные типы ионизирующего излучения имеют разную силу кислородного эффекта. Рентгеновские и гамма-лучи имеют OER около 2.5-3.5, в то время как OER нейтронного излучения равен 1.6, а альфа-лучи вообще почти не имеют кислородного эффекта. Графики ниже наглядно показывают величину кислородного эффекта при использовании различных типов излучения:

Объяснение этой зависимости довольно простое. Дело в том, что кислородный эффект усиливает именно непрямое действие радиации, а если разные типы излучения характеризуются различным соотношением прямых и непрямых повреждений, то и влияние оксигенации будет существенно отличаться.

5. Фракционирование

Фракционирование – это разделение общей дозы облучения на несколько сеансов.

Такое, казалось бы, простое решение кардинально меняет биологический эффект терапии. В этом убедились французские радиобиологи ещё в 20-х годах прошлого века. Они обнаружили, что барана невозможно стерилизовать без обширного повреждения кожи мошонки, подвергая его яички однократному облучению. Но если разбивать дозу на несколько фракций и проводить облучение ежедневно в течение нескольких недель, то стерилизация возможна практически без повреждения кожи.

В этих экспериментах яички рассматривались как модель растущей опухоли, а кожа – как нормальная ткань, ограничивающая дозу. Рассуждения могут быть ошибочными, но вывод оказался верным: фракционирование дозы облучения в большинстве случаев обеспечивает лучший контроль над опухолью при сохранении нормальных тканей.

Для объяснения этого эффекта был предложен принцип четырёх R:

• Repopulation (репопуляция)
• Reparation (репарация)
• Redistribution (перераспределение)
• Reoxygenation (реоксигенация)

Остановимся на каждом из этих R подробнее…

Repopulation (репопуляция)

Если мы разбиваем дозу на несколько фракций, то у ткани появляется совершенно новое состояние, которого не может быть при однократном воздействии радиации. Это состояние ткани в межфракционный период. Именно в этот промежуток времени происходят основные процессы, влияющие на эффективность последующего облучения.

Один из основных процессов, запускающихся в этот период — репопуляция. Во время облучения гибнет множество клеток, а выжившие начинают активно делиться для восстановления популяции. В этот процесс вовлекаются даже «спящие» клетки, которые выходят из фазы G0. Периоды между фракциями — это время для восстановления нормальных тканей. Чем его больше, тем менее выражены побочные эффекты лучевой терапии.

И всё вроде просто и понятно, но репопуляция — палка о двух концах.

Ведь усиленная пролиферация клеток в ответ на повреждение — естественная реакция, характерная и для нормальных тканей, и для опухолевых. Длительные периоды между фракциями дают время не только для восстановления нормальных тканей, но и для опухолевого роста.

Невозможно дать однозначный ответ, что пролиферирует быстрее — опухоль или нормальная ткань. Оба типа тканей крайне гетерогенны по своей пролиферативной активности и имеют широкий спектр от быстрорастущих до медленно обновляющихся популяций. Но существует один интересный эффект - ускоренная репопуляция. Его суть в том, что репопуляция опухолевых клеток в начале лучевой терапии медленная, но затем она ускоряется. При лечении опухолей головы и шеи это явление наступает примерно на 28-й день терапии. Из-за эффекта ускоренной репопуляции необоснованное продление промежутков между фракциями может снизить вероятность локального контроля, ухудшить исход и привести к радиорезистентности опухоли. По этой причине лучевая терапия должна быть завершена как можно скорее, в пределах переносимости.

Reparation (репарация)

Ещё один процесс межфракционного периода — репарация. В норме восстановление клеток занимает около 6 часов, для некоторых типов тканей — до 8 (например, для клеток спинного мозга). Опухолевые клетки часто обладают сниженной способностью к репарации. В процессе малигнизации в них нередко возникают дефекты, приводящие к невозможности быстро и корректно восстанавливать повреждения ДНК.

О чём это нам говорит? О том, что эти временные промежутки необходимо учитывать при планировании облучения. Для сохранения нормальных тканей и снижения риска побочных эффектов интервал между фракциями должен составлять не менее 6–8 часов. Это обеспечивает достаточное время для восстановления здоровых клеток, в то время как опухолевые клетки могут накапливать невосстановленные повреждения.

На репарацию сублетальных повреждений могут оказывать влияния некоторые препараты, выступающие в роли радиосенсибилизаторов. Например, препараты из группы антиметаболитов могут препятствовать восстановлению ДНК после облучения, тем самым приводя к накоплению сублетальных повреждений в опухолевых клетках. Также радиосенсибилизирующий эффект за счёт ингибирования репарации имеют PARP-ингибиторы.

Комбинированная терапия и механизмы синергизма различных препаратов и ионизирующего излучения — это очень интересная тема, заслуживающая отдельной статьи… Но вернёмся к нашим баранам.

Redistribution (перераспределение)

Мы уже говорили о том, что радиочувствительность клетки варьируется в зависимости от фазы цикла. Фазы G2 и M наиболее уязвимы к воздействию излучения, а наиболее резистентными являются фазы S и G1, G0. При облучении погибают в основном клетки, находящиеся в радиочувствительных фазах, а те, которых находились в резистентных, могут выжить. Если разделить общую дозу облучения на несколько фракций, это позволяет дождаться, когда клетки, находившиеся в резистентной фазе, перейдут в чувствительную. В таком случае при последующих фракциях излучение застанет выжившие клетки в уязвимом состоянии. Этот процесс и называется перераспределением, или реассортацией.

Теперь, зная, как работает репопуляция, реассортация и репарация, можно попытаться определить оптимальные с точки зрения радиобиологии промежутки между фракциями. Для этого разберём следующий график:

График показывает, как выживаемость клеток после двух одинаковых доз облучения зависит от временного интервала между фракциями. По вертикальной оси — доля выживших клеток. По горизонтальной оси — время между двумя сеансами облучения. А теперь разберемся с поведением кривой, разобрав её на части.

Начало графика, желтая часть:

При x=0 две дозы облучения подаются одна за другой без перерыва. Выживаемость тут низкая, ведь у клеток нет времени на восстановление. Все нанесенные сублетальные поражения суммируются, приводя к максимальной гибели. По мере увеличения интервала между дозами выживаемость клеток растет: кривая идёт вверх и достигает своего пика. Здесь доминирующий процесс — репарация. Клетки успевают восстановить сублетальные повреждения до того, как получат следующую дозу ионизирующего излучения, что позволяет им выжить.

Середина графика, зеленая часть:

После достижения пика выживаемости кривая идет вниз. Тут доминирующим процессом является перераспределение. Если к моменту первого облучения клетки находятся в случайных фазах клеточного цикла, то после облучения выжившие клетки продолжают свое движение по клеточному циклу и через некоторое время синхронно доходят до чувствительных фаз (G2 и М). Вторая доза облучения в этот момент попадает по максимально уязвимой синхронизированной группе клеток. Это и есть провал на графике: ситуация, в которой лучевая терапия оказывает максимальный эффект.

Конец графика, красная часть:

После провала кривая снова поднимается. Ведь синхронизация — временное явление. Если вовремя не дать вторую дозу, популяция снова становится несинхронизированной, тогда эффект попадания в уязвимую фазу пропадает. Доминировать начинают процессы репопуляции, что ведет к росту кривой. Задача врача-радиотерапевта — выбрать такой режим фракционирования (величину дозы и интервалы между сеансами), чтобы максимизировать губительный эффект ионизирующего излучения для опухоли и при этом дать время на репарацию здоровым тканям.

Reoxygenation (реоксигенация)

Как мы уже обсуждали выше, кислород является мощным радиосенсибилизатором, Но есть одно но. Клетки опухолей почти всегда гипоксичны, ведь дефектные сосуды опухоли не могут обеспечить её достаточным количеством крови. Именно поэтому гипоксические зоны опухоли так сложно уничтожить лучевой терапией: в них часто не хватает кислорода для фиксации радиационных повреждений.

При воздействии ионизирующего излучения погибают в основном оксигенированные опухолевые клетки, в то время как гипоксические остаются резистентными к радиации.

Но что произойдет, если разбить дозу на несколько фракций? Реоксигенация — не такой очевидный, но важный процесс межфракционного периода. В это время часть клеток, находившихся в состоянии хронической гипоксии, получают доступ к кислороду. Механизм реоксигенации прекрасно описывается поговоркой «меньше народу — больше кислороду». После облучения гибнет большое количество опухолевых клеток. А так как мёртвые клетки кислород не потребляют, то он достаётся выжившим гипоксичным “соседям”, делая их более радиочувствительными.

Лучевая терапия — очень интересная (и несправедливо обделенная вниманием студентов) специальность. Если так вышло, что ты студент-медик, но в школе ты любил физику, а душа лежит к чему-то радиационному, то эта специальность точно для тебя!

Take-home message:

• Опухолевая ДНК — основная цель лучевого терапевта.
• Существует два пути взаимодействия с ДНК. Излучение повреждает ДНК либо напрямую (прямое попадание), либо опосредованно (через свободные радикалы от радиолиза воды), причём второй путь встречается чаще.
• Не все излучения одинаковы: у них разные биологические эффекты
• Повреждения ДНК могут быть летальными, сублетальными и потенциально летальными
• Радиочувствительность клетки зависит от фазы её цикла. Самые уязвимые фазы — M и G2
• Кислород является мощным радиосенсибилизатором. Наличие кислорода в опухолевой ткани в несколько раз усиливает повреждающий эффект излучения, «фиксируя» полученные повреждения ДНК.
• Фракционирование — это не просто «поделить дозу». Это стратегия, основанная на четырех основных процессах межфракционного периода: репопуляции, репарации, перераспределении и реоксигенации.

Литература

1. https://psv4.userapi.com/s/v1/d/OHad_DeMhCKBmo-x0vW_h3q5jjdhPUdTvj2npDlN_Bc8yfLRvi5TCgh2CO271J6mugUtpz2l5MUKQwHkZrzddWBsUibrNg4bupRr-Amb3oAJMpl5tmyWYw/Cancer_Principles_and_Practice_of_Oncology_DeVita_11_ed_2019.pdf
2. https://disk.yandex.ru/i/RBLDG_rve9URKg
3. Radiobiology for radiologists, 8 Ed. Eric J. Hall