Основы контраста модуляции Хоффмана

Система Hoffman Modulation Contrast предназначена для повышения видимости и контрастности неокрашенных и живых материалов путем обнаружения оптических градиентов (или наклонов) и преобразования их в вариации интенсивности света. Этот метод был изобретен доктором Робертом Хоффманом в 1975 году и позже оптимизирован Olympus Relief Contrast (ORC).

Базовая конфигурация микроскопа для модуляционного контраста Хоффмана показана на рисунке 1. Пространственный фильтр оптической амплитуды, называемый « модулятором », вставляется в заднюю фокальную плоскость ахроматического, планохроматического или планфлюоритового объектива. Интенсивность света, проходящего через эту систему, варьируется выше и ниже среднего значения, о котором говорят, что оно модулируется. Объективы, теоретически полезные для модуляционного контраста, могут охватывать весь диапазон увеличения от 10x до 100x, но в настоящее время в основном используются в ЭКО для наблюдения за ооцитами и/или эмбрионами. Вот почему компания Olympus оптимизировала HMC с помощью своих объективов Olympus Relief Contrast (ORC) с большим рабочим расстоянием для предпочтительного использования с инвертированным микроскопом IX3.

Модулятор для Hoffman или Olympus Relief Contrast имеет три зоны, изображенные на рисунке 2: небольшая темная зона вблизи периферии задней фокальной плоскости, которая пропускает только один процент света (области, отмеченные буквой « D » на рисунке 2); узкая серая зона, пропускающая 15 процентов (области, отмеченные буквой « G » на рис. 2); и оставшаяся чистая или прозрачная зона, покрывающая большую часть территории позади объектива, которая пропускает 100 процентов света (области, отмеченные « B» на рис. 2). В отличие от фазовой пластинки в фазово-контрастной микроскопии модулятор Хоффмана не изменяет фазу света, проходящего через какую-либо из зон. Микроскопия приобретает видимый трехмерный вид, обусловленный фазовыми градиентами. Модулятор не вносит изменений в фазовое соотношение света, проходящего через различные части модулятора, но влияет на основные максимумы нулевого порядка. Дифракционные максимумы более высокого порядка не затрагиваются. Измерения с помощью интерферометра Майкельсона подтверждают, что фазовые изменения света, прошедшего через модулятор типа Хоффмана, различаются (если они вообще есть) с коэффициентом менее λ/20.

Под сценой конденсор с вращающейся турелью используется для хранения остальных компонентов системы контраста модуляции Хоффмана. Турельный конденсор имеет отверстие для светлого поля с апертурной ирисовой диафрагмой для обычной светлопольной микроскопии, а также для юстировки и создания надлежащих условий освещения Келера для микроскопа. В каждом из других отверстий башни есть смещенная от центра щель, которая частично закрыта небольшим прямоугольным поляризатором. Размер комбинации щели/поляризатора различен для каждого объектива с разным увеличением; отсюда и необходимость в башенном расположении.

Конструкция Хоффмана такова, что щели расположены в передней фокальной плоскости конденсора, как показано на рисунках 1 и 3. Когда свет проходит через внеосевую щель, он отображается в задней фокальной плоскости объектива (также называемой плоскости Фурье ), где установлен модулятор. Передняя фокальная плоскость конденсора, содержащего внеосевую щелевую пластину, оптически сопряжена с модулятором в задней фокальной плоскости объектива. Интенсивность изображения пропорциональна первой производной оптической плотности в образце и регулируется нулевым порядком дифракционной картины фазового градиента.

Принципы контраста модуляции предусматривают, по крайней мере, две основные конфигурации модулятор-щелевая пластина, которые проиллюстрированы на рисунках 2 и 3. Рисунки пластин модулятора, показанные на рисунке 2, преувеличены и увеличены в размерах для целей данного обсуждения. Расположение слева на рисунках 2 и 3 (рис. 2 (а) и рис. 3 (а)) представляет собой симметричную систему, в которой серая полоса модулятора и щель расположены на оптической оси (в центре) микроскопа. Разрешение в этой системе ограничено:

Разрешение = λ/NA

где NA — числовая апертура объектива, а λ — средняя длина волны источника света, формирующего изображение. Темная (пропускание 1 %) и светлая или прозрачная (пропускание 100 %) зоны имеют одинаковый размер, а серая (пропускание 15 %) зона имеет форму узкой полосы, составляющей 10 % диаметра выходного зрачка. цели. Другое расположение (рис. 2 (б) и 3 (б)) является асимметричным или смещенным, когда темная область модулятора находится за пределами выходного зрачка объектива. Разрешение в этой системе значительно улучшено и приближается к:

Разрешение = λ/2(NA)

где значения для NA и λ такие же, как описано выше. Видно, что разрешение в офсетной системе (рис. 3(б)) почти вдвое лучше, чем в центральной (рис. 3(а)) системе. Прозрачная (чистая) зона в офсетной системе заполняет почти 90 процентов диаметра выходного зрачка объектива, а серая и темная зоны заполняют остальные 10 процентов.

Под конденсором на выходном отверстии микроскопа помещается круговой поляризатор. Вращением этого поляризатора можно управлять эффективной шириной щели. Например, «пересечение» обоих поляризаторов под углом 90 градусов друг к другу приводит к «сужению» щели, так что ее изображение попадает в серую область модулятора, как показано на рисунке 3. Часть щели, контролируемая поляризатор регистрируется на яркой области модулятора. При вращении поляризатора можно изменять контраст для достижения наилучшего эффекта. Очень узкая щель дает изображения с очень высокой контрастностью и умеренной степенью когерентности. Изображение оптического сечения также оптимизируется, когда щель установлена в самое узкое положение. Когда круговой поляризатор ориентирован так, что его направление вибрации параллельно направлению вибрации поляризатора в щели, эффективная ширина щели максимальна. Это снижает общий контраст и когерентность изображения, но дает гораздо более качественные изображения более толстых объектов, где существуют большие различия в показателе преломления.

В современных передовых системах модуляционного контраста и модулятор, и щель смещены от оптической оси микроскопа. Такая компоновка позволяет вполне использовать числовую апертуру объектива и обеспечивает хорошее разрешение и детализацию. Формы и детали визуализируются в затененном псевдотрехмерном виде. Они кажутся более яркими с одной стороны, серыми в центральной части и более темными с другой стороны на сером фоне. Модулятор преобразует градиенты оптической фазы в деталях (крутизне, наклоне, скорости изменения показателя преломления или толщины в деталях образца) в изменения интенсивности различных областей изображения в плоскости диафрагмы окуляра. Полученные изображения имеют видимый трехмерный вид с направленной чувствительностью к оптическим градиентам.

Противоположные градиенты приводят к отклонению изображения в щели либо к очень темной части модулятора, либо к яркой части модулятора, как показано на рисунке 5. На этом рисунке гипотетический образец, содержащий как положительный, так и отрицательный градиенты фазы (толщины) и плоская (неградиентная) область отображается с использованием оптических компонентов модуляционного контраста. Отрицательный градиент, изображенный на рис. 5(а), отклоняет свет в темную область модулятора, где он ослабляется примерно до одного процента от своего прежнего значения. Аналогично на рис. 5(с) свет, отклоняемый положительным градиентом в прозрачную область модулятора, не ослабляется, и 100 процентов этого света передается в плоскость промежуточного изображения. Любая неградиентная часть образца (рис. 5(б)), а также фон (окружение) регистрируются на серой части модулятора, где около 15 процентов света проходит в плоскость промежуточного изображения. В результате интенсивность области изображения с одной стороны градиента темная. Интенсивность с противоположной стороны градиента дает яркую область изображения, а области без градиента кажутся серыми на изображении, как и фон.

Контраст (связанный с изменением интенсивности) темных и светлых областей на фоне серого дает эффект затененного псевдорельефа. Это типично для визуализации с модуляционным контрастом. Вращение поляризатора изменяет достигнутый контраст, а ориентация образца на предметном столике (по отношению к поляризатору и смещенной щели) может значительно улучшить или ухудшить контраст.

Поскольку модулятор влияет на изображение щели в зависимости от того, как детали образца смещают изображение щели (и, таким образом, приводит к изменению интенсивности света), он описывается как амплитудный фильтр. Хоффман и другие показали, что фазовые градиенты в образце, как и пространственные частоты, распределяются по всему выходному зрачку объектива. Распределение интенсивности оптического пропускания модулятора обеспечивает удовлетворительное изображение самых разных объектов, создающих фазовые градиенты, включая: все типы клеток и тканей (живые, окрашенные и неокрашенные), а также поверхностные детали кристаллов, прозрачных полимеров, стекол. и другие подобные материалы. Контрастная микроскопия с модуляцией отраженного света также полезна для визуализации границ зерен в непрозрачных и металлургических образцах и поверхностных деталей сложных интегральных схем и других электронных материалов.

Изображения кажутся затененными или псевдотрехмерными, что улучшает видимость из-за различий в контрасте по обе стороны детали. На изображении нет ореолов, в отличие от изображений, полученных с помощью фазово-контрастной оптики. Контрастная модуляция преобразует информацию о фазовом градиенте в разности амплитуд, которые сильно отличаются от вариаций соотношения фаз (и разностей оптических путей), создаваемых фазово-контрастным микроскопом. Использование темных и серых зон в модуляторе дает изображения, содержащие различные оттенки серого и лишенные цвета. Можно ввести цвет в изображения контраста модуляции, создав модуляторы, в которых серые и темные зоны заменены цветными зонами с равными значениями коэффициента пропускания. В таком случае, результирующие изображения из фазового градиента визуализируются в цветах с аналогичными градиентами, имеющими одинаковый оттенок. В настоящее время нам неизвестно ни о каком коммерческом источнике фильтров модуляции, содержащих цветные зоны.

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/java/hoffman/pathways/

Раньше ахроматы или планахроматы широко использовались для модуляционно-контрастной микроскопии, поскольку они могут давать хорошие изображения. Использование этих объективов с зеленым фильтром (помещенным под поляризатор) еще больше улучшит изображение, поскольку ахроматы сферически скорректированы для зеленого света. В настоящее время объективы с более высокой коррекцией, в том числе флюориты и апохроматы, также используются для микроскопии с модуляционным контрастом, и дополнительные затраты оправдывают улучшение качества изображения.

Стоимость модуляционных или контрастных аксессуаров Olympus Relief значительно ниже стоимости оборудования дифференциального интерференционного контраста (DIC). Хотя для обоих методов требуются турельные конденсоры с компонентами, подходящими для каждого объектива, микроскопы, оснащенные ДИК, также содержат поляризатор под конденсором и анализатор, который размещается перед плоскостью промежуточного изображения на оптическом пути. Образцы могут содержаться в пластиковых или стеклянных сосудах без ухудшение изображения из-за поляризационных эффектов, поскольку такие сосуды находятся ниже или выше обоих поляризаторов, а не между ними. Это позволяет системам Olympus Relief и Hoffman быть более полезными, чем DIC, при исследовании и фотодокументировании ооцитов, бластоцист, культур клеток, тканей и органов, проводимых в пластиковых контейнерах.

Есть также несколько недостатков и ограничений системы Hoffman Modulation Contrast. Изображения следует рассматривать с осторожностью, так как разные наблюдатели могут «увидеть» «холм» на изображении как «долину» или наоборот, так как псевдообъемное изображение наблюдается через окуляр. Система наиболее чувствительна к градиентам, перпендикулярным длине щели, в результате чего для достижения наилучшего эффекта требуется некоторая степень умения ориентировать образец.

Непоглощающие образцы не окрашиваются, за исключением наблюдаемых с помощью специального модулятора, содержащего полупрозрачные цветные фильтры вместо серых и темных зон. Образцы, которые естественным образом поглощают определенные длины волн или слегка окрашены, визуализируются в цвете так же, как и образцы, наблюдаемые с комбинацией модуляционного контраста и флуоресценции или с комбинацией модуляционного контраста и поляризованного света.

Конфигурация микроскопа для модуляционного контраста Хоффмана проста, и основные шаги описаны ниже:

Контраст модуляции в проходящем свете

• Прикрепите соответствующие объективы с модуляционным контрастом к револьверу микроскопа и установите турельный конденсор с соответствующими щелевыми пластинами. Если микроскоп оборудован для дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) или поляризационной микроскопии, удалите с оптического пути все поляризаторы, замедляющие пластины и призмы Волластона или Номарского.
• Поместите окрашенный образец (предпочтительно тонкий срез ткани) на предметный столик и, используя объектив 4x, настройте микроскоп на правильное освещение по Кёлеру, как описано в нашем разделе «Анатомия микроскопа» . Для этой операции щелевая пластина модуляционного контраста должна быть удалена из конденсора. Если турельный конденсор имеет положение для светлопольного освещения с апертурной диафрагмой, поверните турель, чтобы выбрать этот конденсор.
• Рассмотрите пластину модулятора в задней фокальной плоскости объектива, используя линзу Бертрана или фазовый телескоп. Убедитесь, что образец удален с оптического пути или перемещен в свободную область на предметном стекле микроскопа.
• Переключитесь на объектив 10x (со встроенным модулятором) и выберите пластину с щелевой апертурой, которая соответствует объективу 10x, переместив соответствующую позицию турели конденсора на оптический путь. Должен быть набор регулировочных винтов или рычаг, который позволяет вращать и перемещать освещающую щелевую пластину внутри конденсора.
• Поместите круговой поляризационный фильтр на световой порт микроскопа под конденсором. Вращайте этот фильтр, наблюдая за изображением в щели через линзу Бертрана (или фазовый телескоп) и наблюдайте, как угол поворота влияет на количество света (яркость), проходящего через поляризаторную часть щели.
• Переместите изображение щели так, чтобы открытая часть без поляризатора накладывалась на серую область пластины модулятора, как показано на рисунке 3 (б). Часть щели, содержащая поляризующий материал, должна отображаться в прозрачной части модулятора справа от серой области. Вращайте круговой поляризационный фильтр и наблюдайте, как появляется и исчезает область щели, содержащая поляризующий материал. Когда плоскость вибрации кругового поляризатора выровнена перпендикулярно плоскости вибрации поляризатора в щели, размер щели минимален, а контраст получается максимальным. Этот маневр можно попрактиковать, используя интерактивное руководство по Java ниже:

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/java/hoffman/alignment/

• Снимите линзу Бертрана или фазовый телескоп и замените окуляр в окулярной трубе микроскопа. Поместите образец-кандидат на сцену и сфокусируйтесь с помощью объектива 10x.
• Отрегулируйте положение конденсора, перефокусировав полевую диафрагму, чтобы добиться четкого фокуса. Откройте полевую ирисовую диафрагму, пока она не окажется за пределами поля зрения.
• Теперь изображение готово для наблюдения или фотодокументирования с модуляцией или Olympus Relief Contrast. Повторяйте описанные выше шаги каждый раз, когда для просмотра образца в модуляционном контрасте выбирается другое увеличение.

И снова мы обнаруживаем, что манипулирование светом в передней фокальной плоскости конденсора (посредством смещенной щели) и манипулирование светом в задней фокальной плоскости объектива (модулятор смещения) могут оказать существенное влияние на представляемое изображение. в окулярах.