Советы о том, как делать более качественные снимки с помощью микроскопа - Микрофотография

Доктор Роберт Бердан

В этой статье я поделюсь некоторыми советами о том, как лучше делать микрофотографии с помощью светового микроскопа. Световой микроскоп может увеличивать образцы от 10 до 1500 раз, но при этом длина волны света ограничивает разрешение. Большинство микроскопов с хорошей оптикой способны разрешать объекты размером примерно до 0,2 микрона или 0,0002 мм (примерно половина длины волны зеленого света). Этого достаточно, чтобы увидеть и сфотографировать клетки и бактерии, но не вирусы. Существуют новые световые микроскопы сверхвысокого разрешения , которые могут различать объекты меньшего размера, но эти микроскопы доступны только в исследовательских учреждениях и стоят дороже дома. Доступные световые микроскопы можно приобрести по цене от 100 до 1500 долларов. Адаптеры для камеры микроскопа стоят от 20 до 1000 долларов, а также есть адаптеры для мобильных телефонов. Amazon продает адаптер для iPhone за 20 долларов .

Выше приведены два адаптера для подключения цифровой зеркальной фотокамеры к микроскопу. Оба адаптера можно приобрести в компании AM микроскопов в Калифорнии . Адаптер слева работает без окуляра, но обычно дает некоторое виньетирование (затемнение) по краям изображения, особенно на полнокадровых цифровых камерах. Эти темные области можно обрезать с помощью графического редактора. Адаптер справа обеспечивает полнокадровые изображения и лучшее качество.

Я также использую адаптеры для камер Olympus, которые вы можете увидеть и прочитать на веб-сайте Алана Вуда. Убедитесь, что диаметр тубуса подходит для любого вашего микроскопа, так как некоторые тубусы микроскопа имеют больший диаметр, чем другие. Есть также много других поставщиков фототрубок.

Выше моя камера Nikon D300, прикрепленная к одному из моих стереомикроскопов с помощью системного адаптера AM, обратите внимание на черную изоленту на трубке, которую я использую для крепления удлинительных трубок и других аксессуаров, когда это необходимо.

Вещи, необходимые для съемки фотографий или фильмов через микроскоп

1. Микроскоп
2. Цифровая камера — предпочтительно цифровая зеркальная камера с одним объективом (DSLR)
3. Способ крепления камеры к микроскопу — см. адаптеры, показанные выше
4. Некоторые знания в области фотографии, микроскопии и образцов, которые вы просматриваете

На этой фотографии показано то, что раньше было моей фотолабораторией, но теперь было преобразовано в рабочую зону для микроскопии с несколькими микроскопами, каждый из которых имеет насадки для фототрубок. На моем ноутбуке установлено программное обеспечение Digicam для записи изображений напрямую через USB-подключение к камерам. Каждый микроскоп имеет свой адаптер для фототрубки. Слева находится моя зона подготовки образцов с банкой, наполненной водой из пруда.

Выше приведена микрофотография собачьей блохи ( Ctenocephalides canis ), сделанная с помощью микроскопа со светлым полем при увеличении 50X — микроскопы со светлым полем хороши для таких объектов с высокой контрастностью. Также обратите внимание на равномерное фоновое освещение. Если на фотографии есть грязь и пятна, их можно легко удалить с помощью графического редактора, но не нарушайте биологическую целостность вашего образца.

Съемка изображений через микроскоп требует базовых знаний о том, как пользоваться микроскопом — основам легко научиться. Есть также несколько различных видов освещения, которые вы можете использовать. Наиболее распространенным является светлое поле, при котором для освещения образца используется белый свет. Микроскопы с ярким полем подходят для просмотра гистологических препаратов, пивных дрожжей и частей насекомых или блох (показано выше). Это не очень хорошо для наблюдения за большинством живых клеток или большинства прудовых организмов, потому что они (например, щечные клетки и простейшие) представляют собой мешки с водой и кажутся полупрозрачными. Вы можете окрасить клетки, но тогда в большинстве случаев вы будете смотреть на мертвые клетки. К счастью, есть методы, которые вы можете приобрести или добавить к своему микроскопу, чтобы сделать прозрачные объекты, такие как клетки, более видимыми или красочными.

Простая техника заключается в использовании двух поляризационных фильтров, добавление к микроскопу темного поля (специальные фильтры или можно просто положить монету на источник света), косое освещение (вставьте лоток для фильтров наполовину), фильтров Райнберга , фазового контраста , модуляции Хоффмана , Флуоресцентное освещение и дифференциальный-интерференционный контраст (ДИК). Некоторые из этих методов просты и дешевы, другие, такие как два последних упомянутых, являются дорогими вариантами.

Köhler Illumination для равномерного освещения

Важным фактором получения хороших микрофотографий является равномерное освещение. Если вы этого не сделаете, у вас будет неравномерное освещение по краям или на одной стороне изображения. Впоследствии это можно исправить в Photoshop (см., как исправить неравномерное освещение на изображениях цифровой микроскопии, но проще и лучше просто правильно настроить свет (см. ссылки ниже, чтобы узнать, как это сделать). В некоторых микроскопах используются встроенные источники света, у других есть зеркало, которое отражает свет до образца. Оба могут быть эффективными, если они предлагают яркий источник света, а микроскоп имеет хороший конденсор. Использование синего матового фильтра также часто может помочь выровнять освещение.

Многие новые микроскопы теперь используют светодиодную подсветку, потому что она яркая, экономичная и служит тысячи часов. На eBay вы можете купить такой же для своего старого микроскопа — они стоят от 150 до 500 долларов (см. ссылку ниже), и это отличный способ оживить старый микроскоп. Я сделал один для своего микроскопа Nikon Optiphot, и он хорошо подходит для микрофотографии.

Источники света

Яркий свет не требуется для просмотра, но он необходим для использования высокой скорости затвора при фотографировании. Высокая скорость затвора может остановить быстро движущихся простейших и уменьшить потерю резкости из-за вибраций, вызванных движением зеркала камеры. Некоторые фотографы используют афокальный метод, чтобы прикрепить свою камеру к микроскопу. По сути, камера расположена над тринокулярной трубкой микроскопа, так что камера не касается микроскопа. Его можно использовать с компактными камерами, телефонными камерами и даже цифровыми зеркальными камерами. Фотографы иногда используют подставку для копирования или другую опору, чтобы держать камеру неподвижно, например, см. статью Чарльза Кребса о микрофотографии.

Я не использую афокальный метод, я предпочитаю прикреплять камеру непосредственно к микроскопу с помощью адаптера. Еще один способ улучшить резкость — использовать в качестве источника света высокоскоростную вспышку. Некоторые фотографы встроили в источник света вспышку. Другие помещают плоскую вспышку ниже предметного столика или откладывают вспышку в сторону и используют светоделитель. Ниже приведены ссылки на статьи Дэвида Уокера о том, как он прикрепляет вспышку к микроскопу. Дэвид описывает один из методов использования покровного стекла или предметного стекла под углом 45 градусов над источником света, чтобы позволить свету проникать сквозь него, а также отражать свет электронной вспышки до образца.

В идеале вы хотите, чтобы вспышка была подключена кабелем к вашей камере и имела возможность использовать TTL (через объектив) замер вспышки. Я попытался отразить вспышку с помощью предметного стекла микроскопа, и это сработало, но при отражении от обычного стекла теряется довольно много света, поэтому я заказал делитель луча 50\50 из Китая на E-bay, и как только он прибудет, я проверю. опять таки. Моя цель — использовать синхронизацию 1\8000 секунды с моей камерой Nikon D500.

Освещение, создаваемое вольфрамовым источником света мощностью 100 Вт на моем микроскопе Zeiss Axioscope, очень яркое, и я могу достичь 1\8000 секунды при ISO 800, но хотел бы достичь этого при ISO 100 или 200, если это возможно, чтобы я мог получить более мелкую зернистость на моих цифровых изображениях с использованием DIC. Другие мои микроскопы имеют встроенные источники света, удобные для просмотра, но не допускающие высоких скоростей затвора. Если вы добавите пару поляризационных фильтров и волновую пластину, это действительно уменьшит количество света и скорость затвора, которую можно использовать.

Я много лет использовал старый слайд-проектор Kodak в качестве источника света и отражал свет от зеркала микроскопа на образец. Совсем недавно я нашел более яркий источник света, купив фонари Nite с сердечником на 2800 люмен (обязательно используйте только их батареи — также обратите внимание, что они дешевле, если вы заказываете из США, а не из Канады) . Эти новые вспышки высокой интенсивности позволяют мне изменять интенсивность света, и я также использую их со своими стереоскопами. Я устанавливаю вспышки на настольную микрофонную стойку за 15 долларов (см. ниже).

Короче говоря, важно настроить освещение микроскопа так, чтобы оно было равномерным по всему образцу и было достаточно ярким для фотографирования, позволяющего снимать движущиеся образцы с короткой экспозицией. На подготовленных или гистологических предметных стеклах объект не двигается, поэтому яркий источник света не нужен, достаточно ровного освещения — потратьте время на настройку освещения, так как это один из важнейших компонентов получения качественных микрофотографий.

Баланс белого

С цветной пленкой важно было использовать специальную пленку с вольфрамовой подсветкой или использовать цветокорректирующие фильтры (синие) для повышения температуры видимого света примерно до 6500 К. С цифровыми камерами можно либо установить баланс белого на камере, либо снимать файлы в формате RAW. и настроить баланс белого во время обработки. Обычно я фотографирую в формате RAW и исправляю баланс белого во время обработки в Adobe Photoshop Camera RAW.

Уменьшение размытия, вызванного вибрацией

У тяжелого прочного микроскопа будет меньше вибраций, чем у легкого микроскопа на хлипком основании. Для проверки на вибрацию слегка постучите подключенной камерой по микроскопу — легко ли она вибрирует? Я также использую ту же технику, чтобы определить, какие штативы устойчивы. Размытие из-за вибрации — распространенная проблема. Использование коротких выдержек или электронной вспышки поможет уменьшить размытие.

Еще одна простая вещь, которая может помочь уменьшить вибрации — это использование антивибрационных прокладок под микроскопом. Некоторые дилеры продают антивибрационные прокладки, а также есть дорогие антивибрационные столы, парящие в воздухе, но они стоят тысячи долларов. Я использовал воздушный стол в своих исследованиях, когда много лет назад делал электрические записи клеток мозга, и они супер, но мой стоил около 7000 долларов! Вы также можете использовать прочную основу из мрамора под микроскопом и убедиться, что у вас есть прочный стол для поддержки микроскопа. Одно из лучших решений, которое я нашел, — это купить резиновые прокладки толщиной 1/4 дюйма, которые используются в спортзалах или тренажерных залах. Эти тяжелые резиновые прокладки стоят около 18 долларов за квадратную прокладку площадью 2 фута, и их можно разрезать по размеру с помощью ножа X-acto. Мне они так понравились, что я сделал коврик для всех своих микроскопов (см. ниже). Они имеют существенное значение и стоят меньше, чем любое другое решение, которое я нашел до сих пор.

Микроскоп

Самым важным фактором в получении хороших снимков, помимо мастерства фотографа, является оптика микроскопа. Окончательное изображение представляет собой комбинацию изображений, создаваемых объективами и окуляром. Из них объективы являются наиболее важными. Объективы микроскопа бывают разных типов: ахроматы, план-ахроматы, флюориты (полуапохроматы) и апохроматы. Если ваша цель — фотография, я бы постарался приобрести объективы Plan Achrom или лучше. Планахроматы исправлены для сферической аберрации и предлагают плоское поле зрения. Объективы ахроматов резкие только в центре поля зрения, и это нельзя исправить с помощью графического редактора. Планахроматы обеспечивают плоское поле поля с резкостью по краям — эти объективы могут иметь некоторые хроматические аберрации (цветовые окантовки), но это можно исправить в графическом редакторе, или вы можете использовать свет одного цвета (зеленый) или преобразовать ваши фотографии в черно-белые. Большинство моих фотографий сделаны с помощью объективов Planachrom, которые относительно доступны. Если вы можете получить в свои руки объективы Fluorite или Apochromat, они лучше оптически скорректированы, но могут стоить в 10-20 раз больше, чем объектив Plan Achrom.

Окуляры для микрофотографии

Окуляр, используемый для микрофотографии, имеет важное значение. В течение многих лет я использовал фотоокуляры Olympus FK, которые обеспечивают плоскую проекцию для фотографирования (доступны 2,5, 3,3 и 5X — есть 1,6X, но редко и очень дорого). Другие производители также предлагают специальные окуляры, предназначенные для микрофотографии. Если возможно, попробуйте использовать один из них для достижения наилучших результатов, а не обычные окуляры, используемые для наблюдения через микроскоп. Адаптер для микроскопа, который я купил у AM systems примерно за 100 долларов, работает достаточно хорошо. Кроме того, при подключении камеры к микроскопу, если адаптер микроскопа не подходит к креплению объектива вашей камеры, я прикрепляю короткую удлинительную трубку к адаптеру с помощью черной изоленты, а затем прикрепляю ее к моей DSLR (цифровой однообъективной зеркальной камере) . Вы можете использовать адаптер удлинительной трубки Nikon для Nikon и адаптер Canon для цифровой зеркальной фотокамеры Canon. Подробнее о фотоокулярах Olympus FK читайте в статье Чарльз Кребс . Мой Zeiss Axioscope Photo-tube поставлялся с объективом внутри, но один только тубус стоил около 1000 долларов, а адаптеры для Nikon или Canon стоили по 75 долларов каждый

В идеале, если вы планируете фотографировать с помощью микроскопа, я рекомендую вам приобрести тринокулярную насадку. Вы можете прикрепить камеры к монокулярному микроскопу или даже к бинокулярным насадкам, но это одновременно затрудняет просмотр через микроскоп. Одним из вариантов, который может быть полезен, является подключение цифровой зеркальной фотокамеры через USB-порт к компьютеру и просмотр изображения на экране во время фотографирования. Есть несколько программ, которые это делают. Я использую управление Digicam, программное обеспечение бесплатное и поддерживает все мои камеры Nikon и Canon. Вы даже можете подключить несколько камер и использовать их для создания видеороликов или интервальной фотосъемки. Его также легко освоить, и он имеет специальную функцию, которая делает экран красным для тех, кто хочет использовать его для астрофотографии. На данный момент он доступен только для компьютеров на базе Microsoft. Бесплатное программное обеспечение для управления Digicam отсюда . С помощью этого программного обеспечения вы можете просматривать изображение на ноутбуке, что требует, чтобы камера находилась в режиме Live View, где зеркало заблокировано, и, следовательно, нет вибрации, вызванной «хлопком» зеркала при съемке. Любой, кто фотографирует с помощью микроскопа, должен взглянуть на это программное обеспечение. Программное обеспечение также позволяет увеличивать изображение на экране, чтобы лучше сфокусироваться. Недостатком является то, что использование вашей камеры в режиме Live View приводит к более быстрому износу батареи, поэтому запасные батареи должны быть заряжены и готовы. Я получаю около 1-2 часов от моих батарей в режиме Live View. Во-вторых, поле зрения часто меньше, чем при взгляде через пару бинокулярных окуляров, и следить за быстро движущимися объектами непросто.

Наложение фокуса

При макрофотографии и микрофотографии с большим увеличением глубина резкости очень мала. Чем выше увеличение, тем меньше глубина резкости. При большом увеличении с использованием объективов 40X, 60X и 100X глубина резкости может составлять микрон или меньше. Чтобы компенсировать это, я часто делаю серию фотографий с разными точками фокусировки, а затем объединяю изображения, складывая их в одно. Я видел, как некоторые фотографы используют до 160 изображений для сложения, в основном я использую от 3 до 40 большую часть времени. Этот метод прост в использовании в Photoshop, или вы можете использовать специальную программу стекирования фокуса, например, Helicon Focus . Недавно я сделал обзор трех программ для стекирования фокуса для микрофотографии — читайте об этом здесь. если вы хотите увидеть, что он может сделать. По моему мнению, наложение фокуса необходимо для многих образцов, просматриваемых с использованием объективов 20X или выше, и дает превосходные фотографии.

Надлежащее покровное стекло. Толщина имеет решающее значение

Покровное стекло обычно представляет собой небольшой квадратный или круглый тонкий кусок стекла, который используется для покрытия образцов, закрепленных на предметных стеклах. Большинство объективов микроскопа адаптированы для использования с покровными стеклами № 1,5, толщина которых в среднем составляет 0,17 мм. Некоторые объективы микроскопов имеют специальные кольца, которые можно поворачивать для корректировки покровных стекол разной толщины, а некоторые объективы предназначены для работы без покровного стекла, например, в металлургических микроскопах. Интересно, что некоторые микроскописты используют покровные стекла № 1 которые тоньше — они утверждают, что важна общая толщина образца и покровного стекла. Следует также отметить, что в любой коробке с покровными стеклами всегда есть некоторая разница в толщине, но для достижения наилучших результатов для большинства образцов я рекомендую использовать покровные стекла № 1,5 или № 1,0. См. эту статью Nikon, показывающую изображение с правильной и неправильной толщиной покровного стекла. Также может иметь значение среда, используемая для просмотра образцов: чем больше разница в показателе преломления среды и образца, тем выше контраст, что важно при постоянной фиксации диатомовых водорослей.

Замедление простейших и других пресноводных беспозвоночных.

Еще один совет, который я использую для получения высококачественных изображений простейших, заключается в том, чтобы расправить покровное стекло на образце, вытягивая воду бумажным полотенцем или куском фильтровальной бумаги. Это делает две вещи: захватывает крупные микроорганизмы, чтобы они не могли перемещаться, и несколько сглаживает их тела, позволяя мне сфокусироваться на одной части организма или сделать серию фотографий, а затем сфокусировать изображения. В первые дни микроскописты использовали специальные устройства, называемые компрессориумами . Даже современные ученые используют вариации этих компрессоров для создания фотографий и фильмов о клетках — например, JA Zinskie et al 2015 . Я нахожусь в процессе изготовления и тестирования некоторых из этих устройств, но на данный момент метод фильтровальной бумаги, похоже, хорошо работает для большинства мелких объектов.

Hands Free Запуск камеры

Еще одна функция, с которой я играю и которая иногда оказывается полезной, — это использование ножной педали USB для срабатывания затвора моей камеры. Это оставляет обе мои руки свободными, поэтому я могу следить за движущимися образцами, используя перемещение предметного столика микроскопа, и менять фокус. Эти триггеры доступны на Amazon.ca примерно за 20 долларов и подключаются к вашему ноутбуку, вы можете настроить их с помощью программного обеспечения для управления Digicam и драйверов, которые они предоставляют.

Существует множество методов замедления и сохранения водных микроорганизмов — хороший обзор см. в статье Джона Делли .

Используя кусок бумажного полотенца или фильтровальную бумагу, я прикасаюсь краем бумаги к краю покровного стекла, чтобы высосать лишнюю воду, которая затем прижимает покровное стекло к образцам. Это часто обездвиживает более крупные микроорганизмы, облегчая их фотографирование — это легко, просто и работает. Также избегайте пластиковых покровных стекол, они не такие оптически прозрачные, как стекло.

Достижение хороших изображений в фотографии и микрофотографии часто связано с заботой о мелких деталях. Важны такие мелочи, как толщина покровного стекла, гашение вибраций, использование режима Live view, использование высокой скорости затвора, использование чистой оптики и чистых предметных стекол, высокая интенсивность света и даже толщина образца.

Если вы не получаете четких изображений, вам следует систематически пытаться выявить причины и внести коррективы. Я всегда пытаюсь настроить свое оборудование, чтобы сделать фотографии чуть более четкими. В микроскопии важны оборудование и техника. То, как человек обрабатывает цифровые изображения, также может иметь существенное значение — я использую маску нерезкости и функцию четкости в Adobe Camera RAW, чтобы попытаться выжать из фотографии как можно больше резкости. Обратите внимание , что микроскописты в прошлом могли создавать потрясающие изображения с помощью пленочных камер и старых микроскопов -- для вдохновения посмотрите микрофотографии диатомовых водорослей , сделанные Джоном Редмэйном в 1877 году .

Таким образом, создание хороших микрофотографий — это сочетание знаний и практики. Важны знания в области микроскопии, фотографии, редактирования изображений и подготовки образцов. К счастью, в Интернете есть масса информации, и специалисты готовы дать совет. Если вы хотите попробовать себя в фотомикрофотографии, я буду рад дать бесплатный совет, а также предлагаю индивидуальное обучение в моей студии для всех желающих. РБ

Ссылки на связанные статьи

Оптическая микроскопия М. В. Дэвидсона и М. Абрамовица — отличный обзор — бесплатная PDF
-микроскопия с самого начала — хороший обзор микроскопии Zeiss — бесплатная PDF
-британская микроскопия — веб-сайт по всем аспектам световой микроскопии
Качественные микроскопы в Калгари
Инструкции Zeiss по настройке Освещение Колера.
Настройка освещения Колера на исследовательском микроскопе Zeiss — видео
Быстрая и простая микрофотография со вспышкой на микроскопе со
встроенной лампой — Дэвид
Уокер Пух и сохранение микроскопических и других водных животных - Дж. Делли.
Иммобилизация живых образцов для наблюдения под микроскопом - бесплатный PDF
AM-микроскоп Адаптеры для подключения камер к микроскопу
Возрождающийся и старый микроскоп
Легко изготовить фильтры для усиления контраста, включая фильтры
темного поля прошлого, настоящего и будущего - PDF

Ссылка: Иллюстрированный справочник по простейшим, 2-е издание (2000 г.) Общество протозоологов.

Связанные статьи о микроскопии Роберта Бердана на этом веб-сайте

1. Микроскопические организмы прудов из Силвер-Спрингс, Калгари
   2. Микроскопическая жизнь в прудах и дождевой воде - прудовая пена I
   3. Фотографирование микроскопических растений и животных - прудовая пена II
   4. Микрофотография и видеосъемка простейших, вольвоксов и коловраток
   5. Домашняя лаборатория микроскопии для Микрофотография
   6. Искусство и наука микрофотографии с поляризованным светом
   7. Фотосъемка через микроскоп Фотомикрофотография - внутреннее пространство
   8. Наложение фокуса в сравнении с Photoshop, Helicon Focus и Zerene
   9. Фильтры Райнберга для микрофотографии
   10. Сканирующая электронная микроскопия - Фотография
   11.Микрофотографии диатомовых водорослей 1877 года, сделанные Джоном Т. Редмэйном.

https://www.canadiannaturephotographer.com/photomicrography_tips.html