Применение флуоресценции в онкологии

В данной статье мы рассмотрим два метода, в которых флуоресценция играет ключевую роль: флуоресцентную интраоперационную визуализацию и фотодинамическую терапию.

Флуоресцентная визуализация

Одной из проблем хирургических операций по поводу солидных опухолей является определение края опухолевой ткани, поэтому зачастую резекция опухоли выполняется не полностью. В связи с этим могут возникать рецидивы опухолей. Точное разграничение областей опухоли и полная хирургическая резекция с отрицательными краями могут улучшить прогноз заболевания и снизить частоту рецидивов.

Чтобы определить границы между нормальной тканью и злокачественными поражениями, для предоперационной диагностики используются компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, позитронно-эмиссионная томография, ультразвуковое исследование. Однако такие методы не используются во время операции.

Для интраоперационной визуализации разрабатываются методы навигации с помощью флуоресцентных красителей - специальных веществ, которые при воздействии на них светом определенной волны испускают свет другой волны, улавливаемый датчиком. Это позволяет в режиме реального времени показать области опухоли (подсвеченные) и нормальных тканей.

Флуоресцентный краситель должен накапливаться в большей степени в опухолевых клетках. Это может происходить двумя способами:

1. Пассивное накопление - накопление, осуществляемое за счет атипичного строения кровеносных сосудов большинства опухолей.

2. Активно-целевое накопление – это накопление флуоресцентного агента из-за связывания с определенными молекулярными мишенями. Часто для такого метода используется не просто краситель, а конъюгат флюорохрома со специфическими направленными на опухоль фрагментами, такими как малые молекулы, пептиды, антитела. Такие конъюгаты уменьшают доставку к нормальным клеткам и избирательно нацеливаются на раковые клетки.

В последнее время стали разрабатываться нацеленные на опухоль флуоресцентные зонды, связывающиеся с мембранными рецепторами раковых клеток (например, с рецепторами фолата, интегрина, с простатспецифическим мембранным антигеном, ферментом циклооксигеназой-2). Так на картинке с мышами выше использован конъюгат флуоресцентного красителя с пептидом, который нацелен на рецептор интегрина.

Для получения оптимального изображения сам флуоресцентный краситель должен соответствовать нескольким критериям:

• Длина волны излучения между 700 Нм и 900 Нм (ближняя инфракрасная область, NIR). Это необходимо для уменьшения помех, связанных с поглощением, рассеянием и автофлуоресценцией, вызванными окружающими тканями.

• Сигнал специфической для мишени флуоресценции должен быть значительно выше, чем автофлуоресценция. Автофлуоресценция - это флуоресценция, возникающая в непораженных тканях после возбуждения светом подходящей длины волны. Флуоресцентным красителям NIR не мешает автофлуоресценция, поскольку ткань пациента обычно проявляет незначительное излучение в этой области.

• Растворимость. Очевидно, что краситель должен быть растворим для введения, например, внутривенно.

• Низкое фотообесцвечивание (чтобы краситель не был подвержен быстрому разрушению света), которое может усложнить наблюдение. Чем ниже фотообесцвечивание красителя, тем выше его стабильность и потенциал практического применения.

• Минимальное неспецифическое связывание (с клеточными мембранами неопухолевых тканей).

Флуоресцентные красители могут применяться не только для определения границ опухолевой ткани, но и для визуализации сторожевого лимфатического узла (sentinel lymph node, SLN), который первым получает лимфодренаж от опухоли.

Обнаружение SLN является клиническим стандартом при диагностике рака молочной железы. Сегодня процедура картирования сторожевого лимфатического узла выполняется с помощью метиленового синего, который не имеет оптимального тканевого контраста и при введении в дерму окрашивает кожу в течении нескольких месяцев.

В последних исследованиях была показана возможность визуализации SLN флуоресцентным красителем индоцианиновым зеленым (ICG) и его конъюгатами.

Фотодинамическая терапия

Флуоресценция может быть полезна не только для визуализации, но и для лечения. В настоящий момент активно разрабатываются методы фотодинамической терапии. Она подразумевает применение специальных веществ - фотосенсибилизаторов, которые способны поглощать свет определенной волны и активировать процессы селективного разрушения клеток.

Фотодинамическая терапия работает по следующему механизму:

1. Фотосенсибилизатор (PS, S0) попадает в клетку, которая затем облучается светом с необходимой длиной волны (совпадающей с длиной, поглощающейся фотосенсибилизатором).

2. Фотосенсибилизатор преобразуется из синглетного основного энергетического состояния S0 в возбужденное синглетное состояние S1 из-за поглощения фотона. Часть энергии излучается в виде флуоресценции, а оставшаяся направляет молекулу фотосенсибилизатора в возбужденное триплетное состояние Т1.

Далее может протекать два механизма:

Тип I

3. В возбужденном триплетном состоянии T1 фотосенсибилизатор передает энергию молекулам из своего окружения. Между фотосенсибилизатором в состоянии T1 и раковой тканью передается водород или электрон, что приводит к образованию свободных радикалов.

4. Электроны взаимодействуют с молекулами кислорода. Этот процесс приводит к производству реактивного кислорода (O2•–,•OH) внутри опухолевых клеток.

5. Каскад реакций приводит к окислительному стрессу, и, в конечном счете, к разрушению раковых клеток.

Тип II

3. В результате перехода фотосенсибилизатора в состояние T1 энергия передается сразу молекуле кислорода.

4. Образуются возбужденные частицы кислорода, в том числе синглетный кислород (1O2), который обладает чрезвычайно сильными окислительными свойствами.

5. Синглетный кислород вызывает фотоповреждение белков, жиров и других молекул. Это приводит к гибели опухолевых клеток в процессе апоптоза и / или некроза.

Фотосенсибилизатор, как и флуоресцентный краситель для навигации, имеет определенные критерии. Схожими являются требования к высокой растворимости, селективности в отношении опухолевых тканей, минимальной автофлуоресценции в области поглощения фотосенсибилизатора/флуорохрома. Также необходима высокая стабильность при комнатной температуре, активация только в присутствии определенной длины волны.

Что касается длины поглощения света фотосенсибилизатора, то она должна быть в диапазоне от 600 Нм до 800 Нм. Поглощение света на длине волны свыше 800 Нм не обеспечивает достаточной энергии для образования синглетной формы кислорода. Поглощение в диапазоне от 400 до 600 нм тоже должно быть минимально, чтобы не происходило разрушение солнечным светом.

Существует 3 поколения фотосенсибилизаторов:

• Первое поколение – препараты на основе порфирина. Они высокотоксичны и слабо накапливаются в опухолях.

• Второе поколение – синтетические фотосенсибилизаторы, самый известный из которых – 5-АЛК (5-аминолевулиновая кислота). Преимуществами перед первым поколением являются большая селективность и лучшее проникновение в глубоко расположенные ткани.

• Третье поколение – малочисленная группа конъюгатов фотосенсибилизаторов второго поколения с антителами, пептидами, полимерными наночастицами.

Фотодинамическая терапия в сочетании с химиотерапией применяется при опухолях кожи: базально-клеточном, метатипическом и плоскоклеточном раке, меланоме и предраковых заболеваниях кожи. Считается, что основным преимуществом фотодинамической терапии является безболезненность, отсутствие токсического воздействия, специфичность, возможность избежать оперативного вмешательства на открытых участках тела.

Резюме

• Для определения границ опухолевой ткани может использоваться флуоресцентная навигация.

• Флуоресцентный краситель накапливается в опухолевых клетках или пассивно или активно, благодаря связыванию флуорохрома или молекулы, соединенной с ним, с рецепторами опухоли.

• Флуоресцентные красители могут применяться для визуализации сторожевого лимфатического узла.

• Фотодинамическая терапия – это способ разрушения опухолевой клетки благодаря образованию в ней активных форм кислорода. Это происходит при активации фотосенсибилизатора излучением определенной длины волны.

• Фотодинамическая терапия применяется в сочетании с химиотерапией для лечения злокачественных новообразований кожи.

Список литературы

1. Ивашкина М.Д., Миронович А.А., Юдаева А.Д. Флуоресценция в онкологии // Medline.ru. Российский биомедицинский журнал. – 2021. – Т. 22. – С. 192-229.

2. Juarranz A, Jaén P, Sanz-Rodríguez F, Cuevas J, González S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. //Clin Transl Oncol -2008 - 10(3)- P.148-154. doi:10.1007/s12094-008-0172-2

3. Tampa M., Sarbu M., Matei C. et al. Photodynamic therapy: a hot topic in dermato-oncology. // Oncology letters. - 2019. - Vol. 17. - 5. - P. 4085-4093. DOI: 10.3892/ol.2019.9939

4. Hernot S., van Manen L., Debie P., et al. Latest developments in molecular tracers for fluorescence image-guided cancer surgery // The Lancet Oncology. - 2019. - Vol. 20. - 7. - P. e354-e367. DOI: 10.1016/S1470-2045(19)30317-1

5. Ogata F., Azuma R., Kikuchi M. et al. Novel lymphography using indocyanine green dye for near-infrared fluorescence labeling // Annals of plastic surgery. - 2007. - Vol. 58. - 6. - P. 652- 655. DOI: 10.1097/01.sap.0000250896.42800.a2

6. Chen, X., Conti, P. S., & Moats, R. A. (2004). In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin alphavbeta3 in brain tumor xenografts. Cancer research, 64(21), 8009–8014. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-04-1956

7. https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/types/photodynamic-therapy