Секвенирование в онкологии
Методы молекулярно-генетической диагностики начали активно применяться в онкологии благодаря развитию таргетной терапии. Наиболее информативным методом, предоставляющим сведения о мутациях в генах конкретного пациента, является секвенирование ДНК - определение последовательности нуклеотидов.
Чтобы лучше понять, какие данные получаются при секвенировании и как они могут быть использованы, следует разобраться с принципами данного метода. Мы разберем работу двух самых часто используемых технологий - секвенирование по Сэнгеру и секвенирование нового поколения (NGS - next generation sequencing).Амплификация фрагментов ДНК
Перед началом секвенирования необходимо увеличить количество копий ДНК-фрагментов, что зачастую делается при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Вначале происходит разделение двуцепочечной молекулы ДНК из-за разрушения водородных связей между комплементарными цепями (1 - денатурация).
Амплификация возможна благодаря работе ДНК зависимой ДНК-полимеразы - ферменту, который копирует нити ДНК. Для её “посадки” на одноцепочечную ДНК в ПЦР используются определенные олигонуклеотидные последовательности - праймеры, которые присоединяются к нитям ДНК фрагментов (2 - отжиг праймеров).
ДНК-зависимая ДНК-полимераза синтезирует новые копии ДНК на матрице исходной молекулы (3 - элонгация). После завершения копирования цепи процесс можно повторять, кратно увеличивая количество отдельных цепей.
Секвенирование по Сэнгеру
Первый способ обработки геномов был предложен биохимиком Фредериком Сэнгером, за что был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.
Первоначально Ф. Сэнгер разработал так называемый «плюс-минус» метод секвенирования ДНК, который не нашел широкого применения в связи с низкой точностью.
Спустя несколько лет, в 1977 году Сэнгер предложил другой метод - “обрыва цепи”, который приобрел ряд модификаций и в настоящий момент может считаться “золотым стандартом” секвенирования.
Его суть заключается в синтезе цепи ДНК на основе исходной цепи в 4 разных пробирках с реакционной смесью, состоящей из праймера, стандартных дезоксинуклеотидов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), а также малого количества радиоактивно меченых дидезоксирибонуклеотидов (ddNTP).
Когда такие измененные нуклеотиды встраивается в растущую цепь, следующий обычный нуклеотид не может присоединиться, и синтез цепи обрывается. Это происходит потому, что в обычном нуклеотиде 3’-гидроксильная группа действует как “крючок", присоединяющий следующий нуклеотид, а в дидезоксирибонуклеотиде (ddNTP) этой гидроксильной группы нет, поэтому никакие другие нуклеотиды не могут быть добавлены (Строение измененного нуклеотида (ddNTP) и обычного (dNTP) показано на рисунке ниже. Синим цветом отмечена 3’-ОН группа).
Смесь сначала нагревают, чтобы денатурировать ДНК-матрицу (отделить две нити), затем охлаждают, чтобы праймер мог связываться с одноцепочечной матрицей. Как только праймер связывается, температуру снова повышают, что позволяет ДНК-полимеразе синтезировать новую ДНК, начиная с праймера. ДНК-полимераза продолжает добавлять нуклеотиды в цепочку до тех пор, пока не происходит добавление дидезоксинуклеотида вместо обычного. В этот момент синтез обрывается.
Этот процесс повторяется несколько циклов, в результате чего образуется набор фрагментов ДНК разной длины, заканчивающихся одним и тем же нуклеотидом (в зависимости от ddNTP, который присутствовал в данной пробирке).
По образовавшимся «обломкам» можно установить последние буквы каждого секвенируемого фрагмента ДНК: для этого содержимое пробирок разделяется электрофорезом в полиакриламидном геле (чем длиннее фрагмент, тем медленнее он двигается в геле), проводится детекция светящихся фрагментов в геле и считывание последовательности нуклеотидов ДНК .
На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано.
Вместо радиоактивно меченных нуклеотидов используются дидезоксинуклеотиды с флуоресцентными метками, каждая из которых имеет разную длину волн испускания, благодаря чему реакцию можно проводить в одной пробирке.
Реакционная смесь разделяется капиллярным электрофорезом, a меченые нуклеотиды затем регистрируются детекторами флуоресценции.
Результаты анализируются компьютером и представляются в виде разноцветных пиков, соответствующих четырем нуклеотидам.
Секвенирование по Сэнгеру является сравнительно недорогим методом выявления мутации, поэтому часто применяется для решения диагностических задач (см. раздел «секвенирование в онкологии»).
Секвенирование нового поколения
Секвенирование нового поколения (NGS) - это группа методов, которая делится на два поколения (второе и третье, т.к. первое поколение -это метод Сэнгера). Наиболее часто использующийся из них - это принцип секвенирования путем синтеза Illumina/Solexa, речь о котором пойдет дальше.
Он принципиально отличается от метода обрыва цепи, рассмотренного ранее.
Методика основана на трех основных этапах:
- Создание библиотеки фрагментов исследуемой молекулы ДНК, добавление специфичных адаптеров к фрагментам, подлежащим секвенированию.
- Амплификация - многократное увеличение копий участка ДНК с помощью полимеразы. Целью этого этапа является увеличение концентрации фрагментов ДНК в пробе, чтобы в дальнейшем провести секвенирование.
- Секвенирование с помощью циклов биохимических реакций (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК).
Вкратце разберемся с каждым из этапов.
- Создание библиотеки
Необходимо понимать, что не существует методов секвенирования, которые могли бы “прочитать” молекулу ДНК целиком.
Поэтому первым шагом является разделение в случайных местах исследуемой ДНК на маленькие фрагменты, например, при помощи ультразвука.
Далее к каждому фрагменту с двух сторон ДНК-лигаза пришивает адаптеры - небольшие ДНК-фрагменты для присоединения к комплементарному олигонуклеотиду подложки и присоединения праймера при секвенировании.
- Амплификация
Принцип амплификации, который используется в технологии Illumina, отличается от рассмотренного выше. Он носит название кластерной мостиковой амплификации.
Следующая часть данного раздела является более углубленной и раскрывает подробности амплификации, которая применяется для секвенирования Illumina/Solexa. Если Вам это кажется слишком сложным и ненужным, предлагаю сразу к пункту 3.Секвенирование.
1) Из двуцепочечной ДНК образуется две одноцепочечные, которые своими адаптерами комплементарно присоединяются к праймерам подложки (проточной ячейки).
2) В систему добавляется все для ПЦР кроме праймеров, т.к. они уже закреплены на подложке (цветные участки). ДНК-полимераза строит комплементарную исходной цепь, начиная с пришитого к подложке праймера.
Теперь каждый исследуемый фрагмент выглядит как двуцепочечная ДНК, конец одной из цепей (ново синтезированной) пришит к поверхности ячейки, а другой – нет (исходная молекула ДНК).
3) В результате плавления ДНК комплементарные цепи расходятся. Цепь, которая не была закреплена на подложке (исходная), удаляется промыванием.
4) Адаптером незакрепленного конца оставшаяся цепь присоединяется к праймеру. Получается фрагмент ДНК в виде «мостика» — один конец пришит к поверхности, другой держится за счет комплементарных взаимодействий.
5) ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь, формируя двуцепочечный «мостик».
6) В результате плавления незакреплённые к подложке концы отрываются, из «мостика» образуются две одноцепочечные нити ДНК, прикрепленные одной стороной к поверхности. При этом одна цепь расположена «вверх ногами» (reverse цепь). Свободный конец каждой из цепей вновь может образовать мостик и цикл повторяется.
7) В итоге вокруг каждого исходного фрагмента ДНК образуется множество его копий.
8)Прикрепленные "вверх ногами" удаляются.
Теперь, когда все копии идентичны исходным фрагментам ДНК и расположены одинаково, можно приступать к тому, зачем мы здесь собрались - собственно к секвенированию :)
- Секвенирование
В технологии Illumina используется секвенирование путем синтеза (sequencing by synthesis - SBS).
Подложка с фрагментами, полученная выше, помещается в раствор с ДНК-полимеразой, праймерами и флуоресцентно мечеными нуклеотидами (ddNTP). В отличие от секвенирования по Сэнгеру, в технологии Illumina используются только меченые нуклеотиды.
Во время каждого цикла секвенирования к цепи добавляется один меченый ddNTP, который приостанавливает полимеризацию, после чего излучается характерный флуоресцентный сигнал, который детектируется специальным прибором внутри секвенатора.
Поскольку добавляемые нуклеотиды имеют блокировку на свободной гидроксильной группе, за 1 цикл может быть добавлен только один нуклеотид. Благодаря этому рост новых цепей синхронизируется. Все новые нити имеют одинаковую длину в конце каждого цикла синтеза, и в этот момент делается снимок (см. рисунок ниже).
В методе Illumina используется обратимый обрыв. Это означает, что тормозящий синтез ddNTP на конце растущей цепи ферментативно преобразуется в обычный dNTP, что позволяет реакциям синтеза продолжаться, а не останавливаться навсегда.
Количество циклов зависит от длины прочтения, однако важно понимать, что прочтение ограничено примерно 250 основаниями (по 250 с каждой стороны при парных прочтениях).
Секвенирование в онкологии
Как говорилось в самом начале статьи, в онкологии всё чаще применяется секвенирование для определения наличия той или иной опухоль-ассоциированной мутации у пациента для подбора таргетных лекарств.
Сейчас большинство секвенирований в клинической практике выполняется по Сэнгеру из-за сравнительной дешевизны одного запуска. Однако у данного метода есть существенный недостаток - низкая чувствительность. Для выявления генной мутации необходимо наличие в предоставленных образцах опухолевых тканей не менее 15-20% клеток с мутациями. Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов.
Заметным явлением в онкологии стало внедрение секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS), к которому относится рассмотренный выше метод Illumina.
Использование NGS позволяет повысить точность и эффективность диагностики.
NGS фиксирует более широкий спектр мутаций, чем секвенирование по Сэнгеру, которое часто ограничивается поиском замещений и небольших вставок и делеций. Секвенирование NGS устраняет необходимость в специализированных анализах (FISH, CGH) при сборе полного спектра геномных изменений.
NGS может обеспечить высокую чувствительность, позволяя обнаруживать мутации, присутствующие всего в 5% ДНК, выделенной из образца опухоли.
NGS может одномоментно проанализировать широкую панель генов (мультигенный подход). Это позволяет выявить причинную мутацию за один раз, не расходуя биоматериал на дополнительные несколько тестов.
Технологии NGS позволяют секвенировать весь геном/экзом/транскриптом или использовать панели с интересующими генами. Интуитивно понятно, что полногеномное секвенирование дороже, его результаты сложнее обрабатываются, поэтому чаще в клинической практике используются панели подтвержденно ассоциированных с опухолью генов.
Существуют различные возможности использования секвенирования в клинической практике.
1) Выбор подходящего лечения
В настоящее время исследование генетического материала у онкологических пациентов нацелено на специфические и хорошо охарактеризованные мутации, способствующие прогрессированию рака. Это делается в первую очередь для подбора таргетного лечения.
Если говорить о возможностях NGS, то для получения наиболее полной информации об изменениях в опухолевых клетках, в исследование можно одновременно включить секвенирование генома (всего наследственного материала), экзома (кодирующих последовательностей) и транскриптома (набора всех транскриптов РНК, включая кодирующие и некодирующие).
Таким способом можно обнаружить структурные перестройки (транслокации, инверсии, слияние генов), изменения числа копий генов, точечные мутации (nonsense, missense, сдвиг рамки считывания) и изменения экспрессии генов. С учетом полученных комплексных результатов могут быть разработаны персонализированные схемы лечения.
2) Диагностика генетически детерминированных онкологий
Секвенирование применяется также для поиска генов, ассоциированных с наследственными опухолевыми синдромами. Подобные ДНК тесты оптимально проводить у людей, входящих в группу риска: имеющих семейную историю одного вида рака в нескольких поколениях.
Для поиска известной мутации, ассоциированной с семейным раком, используется секвенирование по Сэнгеру.
Для обнаружения редких генетических вариантов применяется секвенирование нового поколения из-за возможности одномоментно протестировать большее число генов предрасположенности на наличие в них клинически значимых мутаций в короткие сроки.
3) Поиск новых мутаций
С помощью NGS можно найти новые соматические мутации - потенциальные терапевтические мишени для опухолей различных локализаций. Интеграция технологии в клиническую сферу позволяет быстро проверять предполагаемые взаимосвязи между генотипом, фенотипом и потенциальными методами лечения.
Сокращение времени выполнения работ, снижение затрат на секвенирование и усовершенствования алгоритмов анализа стимулируют развитие NGS в этом направлении.
Резюме
- Секвенирование является удобным инструментом, используемым в клинической онкологии в диагностических и прогностических целях.
- Секвенирование по Сэнгеру является «золотым стандартом» для обнаружения известной опухоль-ассоциированной мутации.
- Секвенирование нового поколения (NGS) позволяет выявить ранее неизвестные мутации, способные стать новыми мишенями для разработки терапевтических агентов.
Список литературы:
- Bennett, Nigel & Farah, Camile. (2014). Next-Generation Sequencing in Clinical Oncology: Next Steps Towards Clinical Validation. Cancers. 6. 2296-2312. 10.3390/cancers6042296.
- Gui Y, Guo G, Huang Y, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder. Nat Genet. 2011;43(9):875-878. Published 2011 Aug 7. doi:10.1038/ng.907
- Imyanitov, Evgeny. (2020). Molecular diagnostics in oncology: new trends. Medical academic journal. 19. 25-32. 10.17816/MAJ19281.
- Roychowdhury S., Iyer M, Robinson D., et al. Personalized Oncology Through Integrative High-Throughput Sequencing: A Pilot Study. Science translational medicine, Vol.3., pp. 111-121, 2011.
- Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-5467. doi:10.1073/pnas.74.12.5463